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Analysis of neutrophil G´granulocytes in experimental head and neck cancer development and progression

Moses, Katrin

In contrast to other cells of the immune system, the role of neutrophils in cancer has only started to emerge in the last decades. Previous studies of our group showed that high infiltration of neutrophil granulocytes in head and neck cancer (HNC) tissues correlated with poor survival of patients with advanced disease. Further in vitro studies indicated that human neutrophils are manipulated by tumor cells to acquire a protumoral phenotype. Neutrophil manipulation by experimental tumors was also described for a variety of tumor types in murine models but HNC models were not yet tested in this respect. Therefore, at first, this study addressed the effect of murine experimental HNC on CD11b+Ly-6G+ cells in the tumor bearing host and, secondly, the role of these cells in HNC progression. A central method for these analyses was the antibody mediated depletion of Ly-6G+ cells. In this regard the efficacy of depletion in different organs of the host and the impact of tumor burden on depletion efficacy were analyzed. Finally, a pilot study in the last part concentrated on a potential role of the murine neutrophil specific molecule Ly-6G for CD11b+Ly-6G+ cell function during neutrophil-tumor interaction. In the transplantable HNC models presented herein, tumors induced accumulation of CD11b+Ly-6G+ cells in the periphery (blood and spleen). Tumors transplanted to an orthotopic site were superior to subcutaneous tumors in this respect. This accumulation correlated with tumor progression in line with observations in HNC patients. Infiltration into the tumor tissue further activated Ly-6G+ cells and induced a protumoral gene expression pattern including increased expression of immunosuppressive Arg1 and iNOS, proangiogenic VEGF and a cytokine pattern that was distinct from splenic Ly-6G+ cells. Using antibody mediated depletion, CD11b+Ly-6G+ cells were found to be mainly implicated in HNC cell seeding and establishment of a tumor while the presence of neutrophils did not further promote advanced tumor progression. The experiments suggested that neutrophils promoted tumor establishment by different mechanisms involving the regulation of T cell functions as well as by providing structural support and inducing angiogenesis. A detailed characterization of antibodymediated neutrophil depletion (using Gr-1 aswell as Ly-6G antibodies) revealed that the depletion in the peripheral blood could be divided into an initial one week complete depletion phase, which was followed by the reappearance of Ly-6G+ cells (rebound phase) despite continued antibody treatment. A depletion resistant pool of viable neutrophils resided in the tumor tissue, spleen and bone marrow during complete peripheral blood depletion. Reappearance of neutrophils during the rebound phase was accompanied by enhanced extramedullary granulopoiesis and occurred faster in tumor bearing mice than in naive mice. Reappearing CD11b+Ly-6G+ cells displayed an immature phenotype and strongly expressed immunoregulatory molecules. In the last part, comparison of neutrophils from Ly-6G+/- and Ly-6G-/- mice suggested that the molecule Ly-6G is not involved in neutrophil-to-tumor migration. Nevertheless, enhanced HNC progression was observed in Ly-6G-/- mice. The underlying mechanism remains to be determined in future studies. In summary, the presented HNC models were shown to possess characteristics of the human disease in terms of tumor-neutrophil interactions. Therefore, further functional analysis as well as therapeutic interventions involving neutrophil functions could be carried out in these models. Depletion experiments showed that CD11b+Ly-6G+ cells strongly promote early phases of tumor growth in this model, most likely by influencing antitumor activity of T cells and by modulation of the recipient tissue niche. During tumor progression, Ly-6G+ cells expand in the blood, spleen, bone marrow and tumor and display tissue specific alterations in function and gene expression. Analysis of Ly-6G+ cells in later phases of tumor growth is limited by the rapid re-appearance of these cells despite continuous treatment with depleting antibodies which is mediated by enhanced extramedullary granulopoiesis and by the presence of viable, migratory, depletion resistant cells in bone marrow, spleen and tumor. This transient, short-term nature of Ly-6G+ cell depletion in the periphery and the continuous presence of tissue resident depletion resistant cells emphasize the need for careful monitoring and cautious interpretation of negative results in murine models of tumor-neutrophil or tumor-myeloid derived suppressor cell interaction.

Die Rolle von Neutrophilen im Zusammenhang mit Krebserkrankungen fand in der Tumorimmunologie lange Zeit wenig Beachtung und wird erst seit einigen Jahren intensiv bearbeitet. In Kopf-Hals-Tumor (KHT)-Patienten mit fortgeschrittenem Tumorstadium konnten vorherige Studien in unserer Gruppe zeigen, dass eine starke Infiltration des Tumorgewebes mit einer schlechten Überlebensrate assoziiert ist. Daraufhin wurden in vitro Untersuchungen durchgeführt, welche zeigten, dass humane Neutrophile in Anwesenheit von tumoralen Faktoren einen tumorfördernden Phänotyp annehmen. Weiterhin sind in der Literatur einige experimentelle Tumorsysteme beschrieben, welche eine tumorfördernde Veränderung von Neutrophilen beschreiben. Untersuchungen zur Rolle von Neutrophilen in murinen KHT Modellen liegen bisher nicht vor. Aus diesem Grund war es ein Hauptziel des ersten Teils der vorliegenden Arbeit, Neutrophile (CD11b+Ly-6G+) in murinen KHT Modellen zu charakterisieren und deren Rolle in Bezug auf die Progression des experimentellen Tumors zu identifizieren. Als zentrale Methode diente hierfür die antiköpervermittelte Depletion von Ly-6G+ Zellen, welche im weiteren Verlauf der Arbeit näher auf ihre Effektivität in unterschiedlichen Geweben untersucht wurde. Weiterhin wurde der Einfluss der Tumorpräsenz auf die Effektivität der antikörpervermittelten Depletion analysiert. In einer abschließenden Pilotstudie sollte außerdem eine potentielle Funktion des neutrophilenspezifischen Proteins Ly-6G, das nur in der Maus vorkommt, im Kontext der Funktion von Neutrophilen in der Interaktion mit Tumoren untersucht werden. Initiale Untersuchungen der vorliegenden Arbeit deuten auf eine Interaktion von Tumorzellen und Neutrophilen hin, welche zu einer tumorprogressionsabhängigen Expansion von CD11b+Ly-6G+ Zellen in der Peripherie (Blut und Milz) führte. Orthotop transplantierte Tumoren lösten in diesem Zusammenhang eine stärkere Expansion als subkutane Tumoren aus. Diese Beobachtungen deckten sich mit Daten aus vorherigen Studien in KHT Patienten. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass die Lokalisation im Tumor zu einer weiteren Aktivierung der CD11b+Ly-6G+ Zellen führte und dass dies die Expression eines tumorfördernden Genexpressionsprofils zur Folge hatte. Dieses war charakterisiert durch immunsuppressive Gene wie Arg1 und iNOS und Gefäßversorgung förderndes VEGF und beinhaltete außerdem verschiedene Cytokine, die weitere Immunzellen anlocken können. Im weiteren Verlauf konnte durch antikörpervermittelte Depletion der Neutrophilen eine zentrale Funktion in der Entstehungsphase der transplantierten Tumoren festgestellt werden, während bereits etablierte Tumoren weniger stark von der Unterstützung durch CD11b+Ly-6G+ Zellen abhingen. Auf funktioneller Ebene wurden durch die gezeigten Experimente verschiedene Mechanismen zur neutrophilenvermittelten Tumorentstehung nahegelegt, wobei sowohl die Regulation von T Zellen als auch eine eher strukturelle Unterstützung des Gewebeumbaus und der Gefäßversorgung eine Rolle spielten. Im nächsten Schritt wurde die antikörpervermittelte Depletion von Ly-6G+ Zellen in einem der KHT Modelle näher betrachtet. Hierbei konnte die Depletion im peripheren Blut in verschiedene Stadien eingeteilt werden. Eine vollständige Depletion wurde während der ersten Behandlungswoche beobachtet und obwohl die Antikörperdosierung fortlaufend aufrechterhalten wurde, kam es nach circa zehn Tagen zu einem Wiederauftreten von Ly-6G+ Zellen. Während der vollständigen Depletion im Blut wurde außerdem eine depletionsresistente Population von lebendigen Ly-6G+ Zellen im Tumorgewebe sowie in der Milz und im Knochenmark identifiziert. Weiterhin wurde die vollständige Depletionsphase durch die Gegenwart eines Tumors weiter verkürzt. In diesem Zusammenhang konnte eine verstärkte extramedulläre Granulopoese festgestellt werden, die zu einer Ansammlung von Neutrophilen führte, welche einen unreifen Phänotyp aufwiesen und weiterhin durch eine hohe Expression von immunmodulierenden Molekülen charakterisiert waren. Im letzten Teil wurde gezeigt, dass die Migration von CD11b+Ly-6G+ Zellen in das Tumorgewebe nicht von der Expression des Moleküls Ly-6G auf der Zelloberfläche abhängt. Trotzdem konnte ein gesteigertes Tumorwachstum in Ly-6G-/- Tieren beobachtet werden. Im Rahmen dieser Studie war es nicht möglich einen zugrundeliegenden Mechanismus zu identifizieren. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass eine Auswahl von murinen KHT Modellen Charakteristika der humanen Erkrankung im Hinblick auf eine Interaktion von Tumor und Neutrophilen widerspiegelt. Das beschriebene Modell kann für weiterführende funktionelle Analysen tumorassoziierter Neutrophiler sowie zur Testung möglicher therapeutischer Interventionen genutzt werden. Depletionsexperimente deuteten darauf hin, dass besonders die frühe Tumorprogression in diesen Modellen stark durch CD11b+Ly-6G+ Zellen beeinflusst wird indem diese die antitumorale Funktion von T Zellen einschränken und außerdem zur Etablierung einer lokalen Nische für die Tumoretablierung beitragen. Während der anschließenden Tumorprogression expandieren Ly-6G+ Zellen in Blut, Milz und im Tumorgewebe und weisen dabei gewebespezifisch veränderte Funktionen auf, welche mit distinkten Genexpressionsmustern einhergehen. Eine Analyse der CD11b+Ly-6G+ Zell Funktionen in diesen späteren Phasen der Tumorprogression ist mittels Antikörperbehandlung durch deren Wiedererscheinen unter Depletionsdruck, welches durch depletionsresistente Zellen und verstärkte extramedulläre Granulopoese induziert wird, nur limitiert möglich. Diese Charakteristika des Depletionsverlaufes unterstreichen die zwingende Notwendigkeit einer peniblen Überwachung der Depletion und implizieren, dass negative Ergebnisse in murinen Krebsmodellen zur funktionellen Rolle von Neutrophilen oder MDSCs besonders vorsichtig interpretiert werden müssen.

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Moses, Katrin: Analysis of neutrophil G´granulocytes in experimental head and neck cancer development and progression. 2017.

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