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Zur Regulation der Genexpression von Trefoil Factor Family (TFF) Peptiden in humanen Retinoblastomzelllinien und zur Bedeutung von TFF3 für das Zellverhalten

Winter, Claudia

Trefoil factor family (TFF) Peptide, die vorwiegend in der Schleimhaut exprimiert werden und dort eine wichtige Rolle in der Wundheilung spielen, werden auch im zentralen Nervensystem sowie in einer Vielzahl verschiedener Tumore exprimiert und beeinflussen das Apoptose- und Proliferationsverhalten von Zellen. Die Regulation der TFF-Expression in Tumorzelllinien, etabliert aus Retinoblastomen, den häufigsten malignen, intraokularen Tumoren des frühen Kindesalters, sowie die Effekte von TFF-Peptiden auf diese Zellen sind bisher noch nicht untersucht worden. Expressionsanalysen in acht humanen Retinoblastomzelllinien aus uni- und bilateralen Tumoren zeigten eine deutliche TFF1-Expression, während TFF3 nur minimal exprimiert wird. In der gesunden humanen Retina war die Expression mit niedrigen TFF1-Leveln und starker TFF3-Expression genau gegensätzlich. In engem Zusammenhang mit einer Veränderung der Genexpression stehen epigenetische Modifikationen wie DNA-Methylierung oder Histon-Deacetylierung. Promotoranalysen im Rahmen dieser Arbeit ergaben eine Korrelation zwischen den endogenen TFF-mRNA-Leveln in Retinoblastomzelllinien und der Dichte der Methylierung in der korrespondierenden Promotorregion. Dabei ist eine dichte Methylierung mit niedriger Genexpression assoziiert, während eine geringe Methylierung die Genexpression steigert. Der direkte Einfluss von Promotormethylierung und Histon-Deacetylierung auf die TFF-Expression konnte in Inhibierungsstudien mit dem DNA-Methyltransferasehemmer 5-Aza-2'-desoxycytidin und dem Histon-Deacetylase-Inhibitor β-Phenyl-γ-aminobuttersäure bestätigt werden. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Wirkung von TFF3 auf das Wachstum, die Zellviabilität sowie das Apoptose- und Proliferationsverhalten von Y-79 Retinoblastomzellen untersucht. Funktionelle Studien nach Applikation von humanem rekombinanten TFF3 sowie nach transienter und stabiler, lentiviraler TFF3-Überexpression zeigten ein vermindertes Zellwachstum und eine deutliche Reduktion der Zellviabilität, die sich in einem signifikanten Anstieg der Apoptoserate der Zellen widerspiegelte. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung der Regulationsmechanismen der TFF-Expression und zur Rolle von TFF3 in Retinoblastomzellen und damit einen ersten Schritt in Richtung neuer, TFF-basierter Therapieansätze für das Retinoblastom.

Trefoil factor family (TFF) peptides, predominantly expressed in mucous epithelia and playing an important role in wound healing, are also expressed in the central nervous system as well as in numerous tumors and have been shown to effect apoptosis and cell proliferation. The regulation of TFF-expression in tumor cell lines established from retinoblastomas, the most common malignant intraocular tumors in early childhood, as well as the impact of TFF-peptides on retinoblastoma cells have not been investigated so far. Gene expression studies in eight human retinoblastoma cell lines derived from uni- and bilateral tumors demonstrated clear TFF1-expression, whereas TFF3-expression was low. By contrast, only weak TFF1-expression levels and high TFF3-expression was observed in the healthy human retina. Epigenetic modifications such as DNA-methylation or histone-deacetylation are in close relation with changes in gene expression. Promoter methylation studies performed in the present thesis clearly indicate a correlation between endogenous TFF-mRNA level in retinoblastoma cell lines and methylation status of the corresponding promoter region, whereby a higher degree of methylation is associated with low gene expression and low methylation increases gene expression. Epigenetic inhibition studies using the DNA-methyltransferase inhibitor 5-Aza-2`deoxycytidine and the histone-deacetylase inhibitor 4-Phenylbutyric acid revealed a direct effect of promoter methylation and histone-deacetylation on TFF-expression. The second part of the present thesis deals with the influence of TFF3 on Y-79 retinoblastoma cell growth, cell viability, apoptosis and proliferation levels. Functional studies demonstrated reduced cell growth and a clear reduction in cell viability due to a significant pro-apoptotic effect after application of human recombinant TFF3 as well as after transient and stable, lentiviral TFF3-overexpression. Taken together, the present thesis provides insights in epigenetic regulatory mechanisms of TFF-expression and reveals an important role of TFF3 in retinoblastoma cells behavior, providing new starting points for TFF-based retinoblastoma therapies.

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Winter, Claudia: Zur Regulation der Genexpression von Trefoil Factor Family (TFF) Peptiden in humanen Retinoblastomzelllinien und zur Bedeutung von TFF3 für das Zellverhalten. 2017.

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