Neue Einblicke in die Heterogenität CD3 Antikörper induzierter T Lymphozyten Reaktionen
Die Interaktion des T Zell Rezeptors (TZR) mit MHC präsentierten Antigenen führt in Anwesenheit eines Ko-Stimulus (z.B. CD28 Ligand) zu einer Proliferation von T Zellen. In vitro wird dies durch eine Kombination aus immobilisierten, monoklonalen anti-CD3 Antikörpern (mAk) und löslichen anti-CD28 mAk simuliert. In der vorliegenden Arbeit wurden T Zell Antworten auf CD3 mAk zweier unterschiedlicher Hybridome, den Klonen CD3/OKT3 (Maus IgG2a) und CD3/UCHT-1 (Maus IgG1) untersucht. Da T Lymphozyten in vivo nicht isoliert von anderen Zellen vorkommen, wurden die Versuche mit mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) durchgeführt. Beide CD3 mAk waren in der Lage ohne Immobilisation und Ko-Stimulus eine vergleichbar effiziente T Zell Aktivierung auszulösen. Dabei proliferierten vor allem CD8+ T Zellen. Eine Stimulation mit CD3/UCHT-1 mAk führte im Gegensatz zum CD3/OKT3 mAk allerdings nicht zur Freisetzung von IL-2. Überraschenderweise wurde auch keine Signalkette über die klassische TZR Signalkaskade induziert. Folglich simulieren CD3 mAk keinen physiologischen T Zell Stimulus.
Funktionelle Analysen zeigten, dass die PBMC aller gesunden Probanden (n = 101) mit Proliferation auf eine CD3/OKT3 mAk Behandlung reagierten, bei einer Stimulation mit CD3/UCHT-1 mAk hingegen proliferierten nur die Zellen von 60% der Probanden (CD3/UCHT-1 Responder und Non-Respondern). Dem zugrunde liegt ein Clustering der TZR, ausgelöst durch die Bindung des Fc Teils (Maus IgG1) der CD3/UCHT 1 mAk von FcγII-Rezeptoren (CD32a) auf Monozyten (CD3/OKT3 interagiert mit CD64). Non Responder verlieren aufgrund eines Basenaustausches im CD32a Gen die Bindungsfähigkeit für murines IgG1. Somit konnte gezeigt werden, dass der CD3/UCHT-1 Responder/Non-Responder Status durch einen Polymorphismus im CD32a Gen determiniert wird. Weiterhin wird deutlich, wie wichtig die Wahl des geeigneten Antikörper-Isotyps für in vivo und in vitro Anwendungen ist.
Erstaunlicherweise fanden sich in Melanom- und Leukämiepatientinnen deutlich mehr Responder als bei den gesunden Probandinnen. Hierdurch konnte erstmals eine Assoziation zwischen dem CD32a Polymorphismus und der Anfälligkeit für Krebserkrankungen hergestellt werden. Ob dies jedoch eine Koinzidenz ist oder ein kausaler Zusammenhang besteht erfordert weitere Untersuchungen. Dabei gewonnene Erkenntnisse können eine Relevanz des „UCHT-1-Responder“-Status für die klinische Anwendung etablieren, beispielsweise als prädiktiver Marker oder für die Therapieempfehlung im Rahmen einer personalisierten medizinischen Behandlung.
According to literature, the interaction of the T cell receptor (TCR) with antigen presenting cells causes T cell activation solely in the presence of co-stimulating factors like CD28-ligands. Since CD3 receptors are required for TCR signaling, immobilized anti-CD3 monoclonal antibodies (mAb) are commonly used in combination with anti-CD28 to mimic T cell stimulation in vitro. In the present study, the mechanism of T cell activation triggered by anti-CD3 mAb was investigated comprehensively utilizing two different anti-CD3 mAbs, namely CD3/OKT3 (mouse IgG2a) and CD3/UCHT-1 (mouse IgG1). Since in vivo T cells do not act independently of other cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were used in these studies. Antibodies of both CD3 hybridomas were found to induce T cell proliferation even in the absence of additional co-stimuli and when applied solubly. Application of soluble CD3 mAb led to enhanced proliferation of CD8+ T cells. The antibodies of both CD3 clones provided analogous T cell responses although there was no detectable IL-2 release from PBMC treated with CD3/UCHT-1. Remarkably antibodies of both clones did not induce proliferation via the TCR signaling cascade.
Functional analyses demonstrated that PBMC from all healthy donors (n=101) responded with proliferation to CD3/OKT3 treatment. In contrast, proliferation was detectable only in PBMC from 60% of the healthy donors treated with CD3/UCHT-1. Further studies showed that CD3/UCHT-1 responsiveness was caused by the presence of monocytes which crosslinked TCRs via binding of CD3 mAb Fc part by Fcγ receptors (FcγRII/CD32a=mouse IgG1 Fc, FcγRI/CD64=mouse IgG2). Therefore, we could show that the state of responsiveness is genetically determined by a polymorphism in the Fcγ receptor CD32a, which renders Non-Responder insensitive to murine IgG1. Surprisingly, the rate of individuals whose cells responded to CD3/UCHT-1 treatment was higher in melanoma and leukemia patients than in healthy donors.
Our results illustrate that anti-CD3 mAbs do not mimic physiological TCR stimulation and emphasize that antibody isoforms for in vitro as well as in vivo applications need to be chosen carefully with respect to their capability of binding Fcγ receptors. Furthermore, CD3/UCHT-1 responsiveness is genetically determined by a CD32a polymorphism and our results indicate that the CD32a genotype might be associated with an increased susceptibility to melanoma. Thus, the pathogenic role of this polymorphism in melanoma development warrants further studies.
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