Analyse genetischer Läsionen im Hodgkin-Lymphom und einem Kombinationslymphom sowie Charakterisierung humaner CD30-positiver B-Zellen

Schneider, Stefanie

Die vorliegende Dissertation stellt drei Studien vor, die Teilbereiche umfassender Projekte sind, die zusammen mit verschiedenen Kooperationspartnern durchgeführt wurden. Im ersten Teilprojekt der Arbeit wurden Mutationsanalysen von CD58 im klassischen Hodgkin Lymphom (cHL) durchgeführt, da Mutationen im CD58-Gen als Mechanismus der Immunevasion in Non-Hodgkin Lymphomen (NHL) beschrieben wurden und Immunevasion auch eine wichtige Bedeutung für die Hodgkin und Reed-Sternberg (HRS)-Zellen des cHL hat. Mittels PCR wurden in 3 von 7 cHL-Zelllinien Mutationen, die in vorherigen Arbeiten identifiziert worden sind, bestätigt. Anschließende durchflusszytometrischen Analysen zeigten deren destruktive Auswirkung auf die Proteinexpression von CD58 in den mutierten cHL Zelllinien. Um zu Überprüfen ob sich Mutationen des CD58-Gens auch in primären cHL Fällen finden lassen, wurde eine Mutationsanalyse von mikrodissektierten HRS-Zellen für die kodierenden Exons von CD58 durchgeführt. Die Auswertung der Sequenzen zeigte allerdings, dass in keinem der 10 analysierten primären cHL-Fälle Mutationen nachweisbar waren. In einem weiteren Teilprojekt wurden die mikrodissektierten Tumorzellen eines Kombinationslymphoms bestehend aus einem cHL und Mantelzell-Lymphom (MCL) genetisch untersucht. Kombinationslymphome sind sehr seltene Kombinationen aus einem HL und NHL oder zwei NHL in einem Patienten, die meistens klonal miteinander verwandt sind. Somit stellen sie interessante Modelle dar, um Gemeinsamkeiten und Unterschiede der beteiligten Lymphome zu untersuchen und Einblicke in die Mehrschrittpathogenese der Lymphomentstehung zu erhalten. Durch IgV-Genanalysen der HRS-Zellen des cHL und der Tumorzellen des MCL konnte die klonale Verwandtschaft der beiden Lymphome dieses Kombinationslymphoms gezeigt werden. Um die Pathogenese des Kombinationslymphoms besser zu verstehen, wurden Mutationsanalysen für häufig mutierte Gene im cHL und MCL, d.h. TNFAIP3, NFKBIA, SOCS1, NOTCH1 und TP53, durchgeführt. Dabei waren jedoch bis auf TP53 alle Gene unmutiert. Die Tumorzellen beider Lymphome wiesen dieselbe Punktmutation in TP53 auf, wobei die MCL-Zellen nur ein mutiertes Allel und die HRS-Zellen zusätzlich ein unmutiertes Allel zeigten. Zusammen mit den FICTION Analysen unserer Kooperationspartner deutet dies darauf hin, dass in beiden Lymphomen zusätzlich eine unabhängige Deletion eines TP53-Allels stattgefunden haben muss. Zusammenfassend lassen die hohe genetische Verwandtschaft der beiden Lymphome und weitere Daten von Kooperationspartner eine subklonale Entstehung des cHL aus dem MCL als ein mögliches Szenario zur Entwicklung dieses Kombinationslymphoms vermuten. Im dritten Teilprojekt dieser Arbeit wurden die humanen CD30+ B-Zellen, die innerhalb von Keimzentren (GC) und in extrafollikulären Regionen von sekundären lymphatischen Organen lokalisiert sind und über die bisher sehr wenig bekannt ist, charakterisiert. Zur Verfügung gestellte Genexpressionsdaten zeigten, dass die CD30+ B-Zellen eine eigenständige B Zellpopulation darstellen, die eine große Ähnlichkeit zu den ebenfalls CD30+ HRS-Zellen des cHLs aufweisen. Kennzeichnend für alle CD30+ Zellen war eine starke MYC Ausprägung, die mittels qRT-PCR und Western Blot-Analysen validiert werden konnte. Zusätzliche durchflusszytometrische Untersuchungen und IgV-Genanalysen in Kombination mit den Genexpressionsdaten zeigten, dass CD30+ GC-B-Zellen normalen GC-B-Zellen entsprechen und vermutlich rezirkulierende positiv selektionierte GC-B-Zellen darstellen. Im Gegensatz dazu stellen die CD30+ Nicht-GC-B-Zellen aktivierte und proliferierende extrafollikuläre Zellen dar, die größtenteils GC-erfahren sind und sich möglicherweise zu Plasmazellen weiterentwickeln.

This thesis presents three studies, which are parts of more comprehensive projects, which were carried out together with various co-operation partners. Mutations in the CD58 gene have been described as a new mechanism of immune evasion in non-Hodgkin lymphomas (NHL). As immune evasion has also an important role for the Hodgkin and Reed-Sternberg (HRS) cells of classical Hodgkin Lymphoma (cHL) a mutation analysis for CD58 was performed for cHL in the first subproject of this thesis. Initially, mutations, which had been identified in previous studies in 3 of 7 cHL cell lines, were confirmed by PCR analysis. Subsequent flow cytometry analysis showed their destructive effect on the protein expression of CD58 in the mutant cHL cell lines. To check whether mutations of the CD58 gene can also be found in primary cHL cases, a mutation analysis of microdissected HRS cells for all coding exons of CD58 was performed. However, no mutations were detected in any of the 10 analysed primary cHL cases. In another subproject, the microdissected tumour cells of a composite lymphoma consisting of cHL and a mantle cell lymphoma (MCL) were genetically analysed. Composite lymphomas are very rare combinations of a Hodgkin Lymphoma and NHL or two NHLs in one patient, which are usually clonally related to each other. They therefore represent interesting models to examine similarities and differences of the involved lymphomas and additionally to gain insights into the multistep transformation process of lymphomagenesis. IgV gene analysis of HRS and MCL cells demonstrated their clonal relationship. To get further insight into the pathogenesis of this composite lymphoma, mutation analyses for genes frequently mutated in cHL and MCL were performed, i.e. TNFAIP3, NFKBIA, SOCS1, NOTCH1 and TP53. However, all but TP53 were unmutated. HRS and MCL cells showed an identical point mutation in TP53, although MCL cells showed only a mutated allele and HRS cells showed an additional unmutated allele of TP53. In combination with the results of the FICTION analysis performed by our co-operation partners these results indicate that in addition a deletion of a TP53 allele occurred independently from one another in both lymphomas. In summary, the close genetic relationship of the two lymphomas together with additional data from our co-operation partners suggest a subclonal evolution of the cHL from the MCL as a possible scenario for the generation of this particular composite lymphoma. In the third part of this thesis the rare human CD30+ B cells were characterized. CD30+ B cells are localized within GCs and in extrafollicular regions of secondary lymphoid organs. Till now very little is known about them. Provided Gene expression data showed that the CD30+ B cells represent a distinct B cell subset, which has a great similarity to the CD30+ HRS cells of cHL. A main common feature of these CD30+ B cells is a strong MYC signature that could be validated by qRT-PCR and Western blot analyses. Additional flow cytometric and IgV gene analysis in combination with the gene expression data showed that CD30+ GC B cells are similar to normal GC B cells and probably represent the recirculating positive selected GC B cells. In contrast, the CD30+ non-GC B cells represent activated and proliferating extrafollicular B cells that are mostly GC experienced and possibly differentiating into plasma cells.

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Schneider, Stefanie: Analyse genetischer Läsionen im Hodgkin-Lymphom und einem Kombinationslymphom sowie Charakterisierung humaner CD30-positiver B-Zellen. 2015.

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