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Optimierung der Isolation humaner nicht-parenchymaler Zellen der Leber und Charakterisierung ihrer immunregulatorischen Bedeutung

Werner, Melanie

Die chronische Infektion mit dem Hepatitis C Virus (HCV) ist unter anderem mit einer erhöhten Expression von Interferon sensitiven Genen (ISG) in der Leber verbunden. Die chronische Infektion mit dem Virus kann zur Entstehung von Leberfibrose, Leberzirrhose oder zum hepatozellulärem Karzinom (hepatocellular carcinoma, HCC) führen. Nicht-parenchymale Leberzellen (NPC) spielen in der angeborenen Immunabwehr und bei der Induktion der Immuntoleranz eine entscheidende Rolle. Ihre Funktion in der Abwehr gegenüber dem HCV ist nicht vollständig geklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde die simultane Isolation von Hepatozyten, Kupffer Zellen (KC), lebersinusoidalen Endothelzellen (LSEC) und hepatischen Sternzellen (HSC) aus humanem Lebergewebe optimiert. Die kultivierten Zellen wurden im Hinblick auf ihre Morphologie, der Expression von zelltypspezifischen Markern sowie der zelltypspezifische Kontrolle der physiologischen Aktivität bewertet. Die hier verwendete Methode führte zu hoch reinen Primärzellpopulationen mit erhaltener physiologischer Aktivität in vitro. Anschließend wurde das TLR System in kultivierten KC, LSEC und HSC analysiert. Die Stimulation der TLR1-9 führte zur Aktivierung unterschiedlicher Signalwege. Hierzu zählt unter anderem die Aktivierung des Transkriptionsfaktors nuclear factor-kappaB (NF-κB) und des mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) Weges (JNK, p38 und ERK1/2). Darüber hinaus führte die Stimulation der TLR1-9 in KC, LSEC und HSC zu einer zelltypabhängigen Produktion inflammatorischer Zytokine (Interleukin-6 (IL-6), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und IL-10). Zur Untersuchung der antiviralen Aktivität von KC, LSEC und HSC wurde das Con1 HCV Replikonsystem verwendet. Die Stimulation von Con1 Zellen mit den Überständen von NPC, die zuvor mit TLR1-9 Liganden behandelt wurden, führte ausschließlich im Fall von TLR3 zu einer Suppression der HCV Replikation. Des Weiteren führte diese Stimulation zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors interferon regulatory factor 3 (IRF3), der ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die Induktion von Interferonen (IFN) darstellt. Die Stimulation mit dem TLR3 Liganden Poly I:C führte in allen drei Zelltypen zur Produktion von IFN-α, IFN-β, IFN-λ1 IFN-λ2 und IFN-λ3 sowie von ISG. Zur Identifikation von Mediatoren, die den antiviralen Effekt vermitteln, wurden Experimente zur Neutralisation von Typ I und Typ III Interferonen sowie deren Rezeptoren durchgeführt. Hierbei wurde festgestellt, dass der antivirale Effekt über den Typ I IFN Rezeptor verläuft. Allerdings wurde durch die Neutralisation von IFN-α und IFN-β der antivirale Effekt nicht aufgehoben, so dass nicht ausgemacht werden konnte, welches Typ I IFN für diesen Prozess verantwortlich ist. Um den Einfluss der HCV Infektion auf die TLR Sensitivität der NPC zu untersuchen, wurden Zellen aus HCV infizierten Patienten mit Zellen aus nicht infizierten Patienten verglichen. LSEC von HCV positiven Patienten reagierten auf die Stimulation mit dem TLR3 Liganden Poly I:C mit einer gesteigerten Genexpression von IL-6, IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2 und IFN-λ3, während in KC und HSC lediglich geringe Unterschiede im Fall von IL-6 und TNF-α festgestellt werden konnten. Zusammengefasst konnten in der vorliegenden Arbeit humane Hepatozyten, KC, LSEC und HSC mit einer hohen Zellzahl, einer hohen Reinheit und einer erhaltenen physiologischen Aktivität isoliert und kultiviert werden. Die kultivierten NPC zeigten eine funktionierende TLR Signaltransduktion, die zur Produktion von inflammatorischen Zytokinen und Interferonen führte. Ein antiviraler Effekt wurde ausschließlich nach der Stimulation des TLR3 vermittelt und scheint über die Produktion von Typ I Interferonen zu verlaufen. Die hier dargestellten Erkenntnisse geben Aufschluss über die Funktion der KC, LSEC und HSC in der Immunabwehr und Immuntoleranz gegenüber dem HCV.

The hepatitis C virus (HCV) infection is associated with increased expression of interferon sensitive genes (ISG) in the liver. Chronic infection with HCV is a leading cause for the development of liver fibrosis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Non-parenchymal liver cells (NPC) play an important role for innate immunity and for induction of immune tolerance. Though, their function in the defense against HCV is not well understood. In this study, we optimized the isolation process for hepatocytes, Kupffer cells (KC), liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) and hepatic stellate cells (HSC) from human liver tissue. Cultured cells were evaluated for morphology, expression of cell type-specific markers and cell type-specific physiological activity. The presented method resulted in high purity of cell populations with retained physiological activity in vitro. To elucidate the impact of NPC on hepatic immunity, the toll-like receptor (TLR) system was analyzed. Stimulation of TLR1-9 led to the activation of different signaling pathways. Among others, TLR stimulation led to activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB (NF-κB) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway (JNK, p38 and ERK1/2). Furthermore, the stimulation of TLR1-9 in KC, LSEC and HSC led to cell type-dependent production of inflammatory cytokines [Interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF α) and IL-10]. A subgenomic HCV replicon system (Con1) was used in a co-culture model to further investigate the antiviral capacity of TLR-activated KC, LSEC and HSC. Con1 cells were exposed to supernatants of NPC that were stimulated with TLR1-9 ligands. Suppression of HCV replication was observed exclusively after treatment with supernatants of TLR3-activated NPC. TLR3 stimulation in NPC with polyinosinic-polycytidylic acid (Poly I:C) led to activation of the transcription factor interferon regulatory factor 3 (IRF3) that is crucial for the induction of interferons (IFN). Gene expression of IFN-α, IFN-β, IFN-λ1 IFN λ2, IFN λ3 and ISG was induced after Poly I:C treatment in a cell type-specific manner. To identify mediators of the antiviral effect, we neutralized type I and type III interferons as well as their respective receptors. We demonstrated that the antiviral effect was mediated by the type I IFN receptor. However, the suppressive effect on the HCV replication could not be abolished by neutralizing IFN-α or IFN-β. To investigate the influence of HCV infection on the TLR-mediated cytokine production, we compared the TLR-mediated responses of NPC isolated from HCV-infected patients and uninfected controls. LSEC isolated from HCV-positive donors responded with a stronger increase in gene expression of IL-6, IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2 und IFN-λ3 after stimulation with the TLR3 ligand Poly I:C. KC and HSC exhibited only marginal differences for the IL-6 and TNF-α gene expression between both groups. In summary, we have developed a technique to simultaneously isolate hepatocytes, KC, LSEC and HSC from human liver samples. This technique results in high yields and sufficient purity of cultured cell populations. Isolated cells retained their physiological activity in culture. Cultured NPC exhibited a functional signal transduction of the TLR system, which led to production of inflammatory cytokines and interferons. An antiviral response was restricted to the stimulation of TLR3 and seems to be mediated by the production of type I interferons. The presented results shed new light on the role of KC, LSEC and HSC as part of the hepatic immunity against HCV infection.

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Werner, Melanie: Optimierung der Isolation humaner nicht-parenchymaler Zellen der Leber und Charakterisierung ihrer immunregulatorischen Bedeutung. 2015.

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