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Die Rolle der Rezeptortyrosinkinase TrkA in Checkpoint Aktivierung, DSB Reparatur, und Proliferation von Neuroblastomzelllinien

Rudolf, Ines

Neuroblastome sind die häufigsten extrakranialen Tumore des Kindesalters. Diese maligne Erkrankung zeichnet sich durch eine extreme Spannweite der Krankheitsverläufe aus, die von spontaner Differenzierung und Tumorregression bis hin zu raschem Progress und infauster Prognose reicht. Hohe Expressionslevel der Rezeptortyrosinkinase TrkA/NTRK1 sind mit einer guten Prognose assoziiert. TrkA/NTRK1-Expression korreliert zudem mit einer höheren Expression des DNA-Reparaturproteins XRCC4 in stabil TrkA/NTRK1-exprimierenden SY5Y Zellen. Stabil transfizierte SY5Y Zellen mit induzierbarer TrkA/NTRK1-Expression wurden genutzt, um den Effekt dieses Neurotrophin-Rezeptors auf Zellviabilität, Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints und die DNA-Reparaturkapazität in der Strahlenantwort zu analysieren. Hierbei konnte kein Einfluss von TrkA/NTRK1 auf die Reparaturkapazität oder die DNA Reparaturkinetik im Zusammenhang mit ionisierender Bestrahlung festgestellt werden. Jedoch wurde gezeigt, dass die Überexpression von TrkA/NTRK1 eine Defizienz im G2-Kontrollpunkt bei niedrigen (1 Gy) und hohen (4 Gy) Dosen bedingt. Zudem war die Zellviabilität in TrkA/NTRK1-positiven Zellen im Vergleich zu TrkA/NTRK1-negativen Zellen nach Bestrahlung erhöht. TrkA/NTRK1-exprimierende Zellen zeigten außerdem eine signifikant erhöhte Zellviabilität nach PARP1-Inhibition durch Olaparib mit und ohne Bestrahlung mit 2 Gy. Die häufigste genetische Veränderung beim Neuroblastom, welche nur ein einzelnes Gen betrifft, ist die Amplifikation des MYCN Onkogens. Diese definiert auch den aggressivsten Tumor-Subtyp, der mit gegenwärtigen Mitteln nicht kurativ behandelt werden kann. Die MYCN-Amplifikation ist anti-korreliert zur Expression der Rezeptortyrosinkinase TrkA/NTRK1 und des Zelloberflächen-Glykoproteins CD44, die wiederum mit einer günstigen Prognose und spontaner Tumorregression assoziiert sind. Wir konnten einen direkten Zusammenhang zwischen hohen TrkA/NTRK1-Leveln und der Hochregulation von CD44 in Neuroblastomzellen mit induzierbarer TrkA/NTRK1-Expression zeigen. Dabei wurden die CD44 Spiegel auf mRNA und Proteinebene in Gegenwart und Abwesenheit von aktiviertem TrkA untersucht. Hochregulation von CD44 konnte nur nach TrkA/NTRK1-Aktivierung durch den spezifischen Liganden, Nerve Growth Factor (NGF), gezeigt werden. Zudem ist das MYCN Protein in TrkA/NTRK1-exprimierenden Zellen mit MYCN-Amplifikation runterreguliert. Die Proliferationsrate und die Koloniebildungsfähigkeit sind in TrkA/NTRK1-exprimierenden, MYCN-amplizierten Neuroblastomzellen signifikant erniedrigt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine Deregulation der Zellzyklus-Kontrollpunkte und ein verändertes Ansprechen auf Olaparib- in Einklang mit einer Rolle von TrkA/NTRK1 bei der Zellzykluskontrolle stehen. Eine reduzierte Expression von MYCN-Protein in Abhängigkeit vom TrkA/NTRK1-Status zusammen mit verminderter Koloniebildungsfähigkeit und Zellproliferation in MYCN-amplifizierten Neuroblastomzelllinien weist auf eine gegenseitige Interaktion von TrkA/NTRK1 und MYCN hin.

Neuroblastoma is the most common extracranial tumor of childhood. It is characterized by extreme courses of the disease ranging from spontaneous regression to rapid progression with infaust outcome. High expression of the receptor tyrosine kinase TrkA/NTRK1 is associated with a favorable outcome in neuroblastoma. TrkA/NTRK1 had been associated with an upregulation of a major factor in non-homologous end-joining (NHEJ), XRCC4, in SY5Y cells stably expressing TrkA/NTRK1. Here, stably transfected SY5Y cells carrying an inducible vector for TrkA/NTRK1 were used to analyze the effect of this neurotrophin receptor on cell viability, checkpoint activation, and the DNA repair capacity of these cells in response to ionizing irradiation. No differences in DNA repair capacity were found in response to TrkA/NTRK1-expression. However, inducible TrkA/NTRK1 over-expression induced a deficient G2 checkpoint at both low (1 Gy) and high doses (4 Gy) of ionizing radiation. Furthermore, cell viability was increased in TrkA/NTRK1-positive cells post-IR compared to vector control cells. TrkA/NTRK1-positive cells up-regulated PARP1 and showed significantly increased cell viability compared to TrkA/NTRK1-negative controls after PARP1-inhibition by Olaparib with and without irradiation with 2 Gy. Amplification of the MYCN oncogene is frequently observed in high-stage neuroblastoma, which cannot be treated currently with curative intent. Furthermore, MYCN amplification is inversely correlated to expression of both the neurotrophin receptor TrkA/NTRK1 and the cell surface glycoprotein CD44. We have found a direct link between TrkA/NTRK1 and up-regulation of CD44 using neuroblastoma cells with inducible, ectopic expression of TrkA/NTRK1. CD44 was elevated both on the mRNA and protein level only after induction and activation of TrkA/NTRK1 by its specific ligand, nerve growth factor (NGF). Furthermore, MYCN protein was found down-regulated in response to TrkA/NTRK1-signaling in MYCN-amplified transfectants with inducible TrkA/NTRK1-expression. Additionally, proliferation rates and clonogenic survival were significantly decreased in TrkA/NTRK1-positive, MYCN-amplified neuroblastoma cell lines. Taken together, checkpoint deregulation and altered Olaparib response suggest a role for TrkA/NTRK1 in cell cycle regulation and checkpoint control. Furthermore, down-regulation of MYCN in response to TrkA/NTRK1-expression together with decreased clonogenic survival and proliferation of MYCN-amplified neuroblastoma cell lines points to an interaction of TrkA/NTRK1 and MYCN, possibly through CD44- and GSK3ß-signaling.

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Rudolf, Ines: Die Rolle der Rezeptortyrosinkinase TrkA in Checkpoint Aktivierung, DSB Reparatur, und Proliferation von Neuroblastomzelllinien. 2018.

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