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Wilms' tumor 1 (WT1) specific immune cells as a tool for cellular immunotherapy in acute myeloid leukemia

Danielzik, Tina

Rezidive sind die häufigste Todesursache bei Patienten mit Akuter Myeloischer Leukämie (AML). Deshalb hat sich die Wissenschaft in den letzten Jahren zunehmend mit supportiven Therapieansätzen wie adoptiver Immuntherapie beschäftigt, die als eine Art Prophylaxe nach Stammzelltransplantation verabreicht werden soll, um restliche leukämische Blasten zu zerstören. Vielversprechende Ansätze sind bereits in klinischer Anwendung, allerdings zielen Erfolge immer nur auf relativ kleine Patientengruppen ab. Daraus lässt sich schließen, dass bisher noch keine optimale Immuntherapie gefunden wurde, die breitgefächert einsetzbar ist. Zeitaufwendige Herstellung von Effektorzellen gegen restliche leukämische Blasten sowie mangelnde Spezifität und Immunogenität behindern die Entwicklung optimaler Immuntherapien, die möglichst schnell und spezifisch in der Klinik eingesetzt werden sollen. Nachdem WT1 als vielversprechendes Tumorantigen identifiziert werden konnte, das auf leukämischen Blasten hoch exprimiert wird, diente es in diesem Projekt als Zielstruktur für eine adoptive Immuntherapie. Zu Beginn wurde die initiale Frequenz von WT1-spezifischen Zellen aus AML Patienten mit ELISpot und FluoroSpot gemessen. Die daraus resultierende, niedrig-frequente Zellpopulation mit 0,001-0,013 % WT1-spezifischen Zellen wurde im Folgenden expandiert, um ausreichende Zellmengen für adoptiven Zelltransfer herzustellen. Unterschiedliche Expansionsansätze wurden miteinander verglichen, ergaben aber unter optimalen Bedingungen nur eine 4-fache Vermehrung von WT1 spezifischen Zellen, verglichen mit der Ausgangspopulation. Abhängig von der vorgegebenen Menge an transfundierten Zellen, die für die klinische Anwendung notwendig ist, reicht dieser Expansionsansatz nicht für therapeutische Zwecke. Die expandierten Zellen bestanden im Wesentlichen aus zytotoxischen CD8+ T Zellen, die IFN-ɣ und Granzym B sezernieren, aber nicht aus Effektor Memory Zellen. Um die Funktionalität der Effektorzellen zu testen, war ein weiteres Ziel des Projektes die Etablierung geeigneter Zielzellen, die WT1 präsentieren. Hierfür wurden AML-spezifische Zelllinien und AML Blasten aus Patienten im Europium Assay auf ihre Lyse durch Effektorzellen untersucht. Da Zelllyse nicht nur von funktionellen Effektorzellen abhängig ist, wurde WT1 auf mRNA Ebene mit qRT-PCR und auf Proteinebene mit Western Blot Analyse und mittels Durchflusszytometrie untersucht. Spezifische Lyse konnte nur bei AML Zelllinien und nicht bei Patientenblasten festgestellt werden, was vermutlich auf Tumor Escape Mechanismen von AML Blasten zurückzuführen ist. Berücksichtigt man aktuelle Therapieansätze mit manipulierten T-Zellrezeptoren oder genetisch modifizierten T-Zellen für die Rezidivbehandlung, so scheint die Expansion von nicht-modifizierten, WT1-spezifischen Effektorzellen weniger erfolgreich, da eine hohe Avidität der angereicherten T-Zellen ein Problem darstellt.

Relapse after haematopoietic stem cell transplantation remains a major cause of mortality for patients with Acute Myeloid Leukemia (AML). The generation of adoptive immunotherapies for treating relapse in AML patients is an emerging field that already showed promise in a number of clinical trials. The idea of targeting residual leukemic blasts with adoptive transfer of antigen specific T cells developed over the years by improved understanding of T cell activation strategies and target structure recognition. Nevertheless, many obstacles such as insufficient effector cell numbers after expansion, low avidity of specific cells, time-consuming generation and application to only a small number of patients, need to be overcome. Since the WT1 protein has proven to be a promising tumor-associated antigen being highly expressed on leukemic blasts, it has been studied as a target structure for the generation of an adoptive immunotherapy in this project. Consequently, investigation aimed at the identification of putative WT1-specific effector cells by determining WT1-specific frequencies in ELISpot and FluoroSpot assay. Initial frequencies in AML patients were found to be relatively low (0.001- 0.013 %) concluding that WT1-specific cells have to be expanded ex vivo in order to generate sufficient cell numbers for an immunotherapy. The proliferative potential of WT1-specific cells was then tested in different expansion strategies that resulted in at most 4-fold expansion of WT1-specific cells under optimised conditions. Compared to expansion protocols for clinical application, generated cell numbers were not sufficient for adoptive transfer yet. Furthermore, expanded cells mainly consisted of cytotoxic CD8+ T cells secreting IFN-ɣ and granzyme B, but not of effector memory cells. To assess effector cell functionality, one aim was the identification of suitable target cells expressing WT1 that could be lysed by WT1-specific effector cells. The lytic activity of effector cells against AML cell lines and AML blasts from patients was tested by Europium release assay. Since lysis does not only depend on WT1 recognition, WT1 levels were determined by qRT-PCR, Western Blot analysis and flow cytometry. Specific lysis of AML targets could only be achieved in AML cell lines but not in AML blasts. Tumor escape influenced by various factors is discussed to be the major stimulus of relapse which could be an explanation for these results. Considering existing approaches with TCR editing and genetically modified T cells as adoptive immunotherapies for relapse prevention, it seems that immunotherapies with non-modified cells cannot keep up with current requirements for rapid generation of highly WT1-specific cells. Although many expansion strategies have proven successful for the generation of WT1-specific effector cells, T cell avidity remains a problem.

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Danielzik, Tina: Wilms' tumor 1 (WT1) specific immune cells as a tool for cellular immunotherapy in acute myeloid leukemia. 2015.

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