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Evaluierung der klinischen und biologischen Relevanz von CEACAM1 Spleißvarianten im malignen Melanom

Ullrich, Nico

Das maligne Melanom beruht auf der Entartung von Pigmentzellen (Melanozyten) in der Haut und stellt die aggressivste Form aller Hauttumore dar. Das hohe Metastasierungspotential von Melanomzellen bestimmt hierbei die hohe Anzahl an melanomassoziierten Todesfällen. Die Deregulierung von Zelladhäsionsmolekülen nimmt hierbei eine entscheidende Rolle ein. So konnte gezeigt werden, dass die neo-Expression des Zelladhäsionsmoleküls CEACAM1 in Melanomzellen mit einer gesteigerten Motilität dieser einhergeht und folglich mit einer schlechteren Prognose für Melanompatienten im frühen Stadium (I und II) korreliert. Da CEACAM1 nicht auf Melanozyten, jedoch auf ~80 % aller Melanomzellen exprimiert ist, gibt es neue Ansätze für CEACAM1-basierte Immuntherapien. Im humanen System werden vier CEACAM1 Spleißvarianten exprimiert, wobei keine umfassenden Studien durchgeführt wurden, welche sich mit der klinischen und biologischen Bedeutung dieser Spleißvarianten befassen. Es ist bekannt, dass die Isoformen CEACAM1-4L, CEACAM1-4S, CEACAM1-3L und CEACAM1-3S durch alternatives Spleißen generiert werden, diese unterscheiden sich in der Anzahl ihrer extrazellulären Domänen und der Länge ihrer zytoplasmatischen Domänen. In der vorliegenden Doktorarbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass alle vier CEACAM1 Spleißvarianten sowohl in Melanomzelllinien als auch in Melanombiopsien exprimiert werden. Dabei korreliert die Expression der CEACAM1-3 Isoformen signifikant mit dem klinischen Stadium der Melanompatienten. Zudem ergab sich eine Korrelation zwischen der CEACAM1-3S Expression in Melanomen und einem signifikant verlängerten Gesamtüberleben von Melanompatienten. Experimente mit CEACAM1 Isoform-spezifischen Transfektanten lassen vermuten, dass das verlängerte Überleben dieser Patienten in einer verringerten Motilität und einer erhöhten Immunogenität der CEACAM1-3S exprimierenden Melanomzellen begründet ist. In der hier präsentierten Arbeit zeigte sich, dass CEACAM1-3S die Migrations- und Invasionsfähigkeit von Melanomzellen und die Fähigkeit matrixunabhängig zu wachsen vermindert. Zudem konnte eine Korrelation zwischen der CEACAM1-3S Expression und der Oberflächenexpression von MICA, ULBP2 und CD155 festgestellt werden. Bei diesen Molekülen handelt es sich um Liganden für die aktivierenden NK-Zellrezeptoren NKG2D bzw. DNAM-1. Die erhöhte Expression dieser Liganden ging mit einer erhöhten NK-Zell-vermittelten Zytolyse der CEACAM1-3S-exprimierenden Melanomzellen einher. Weiterhin ergaben die Analysen der restlichen Isoformen antagonistische Effekte. Für die CEACAM1-4 Isoformen konnten motilitätssteigernde Effekte nachgewiesen werden, welche bei CEACAM1-4L wahrscheinlich auf die gesteigerte Aktivität der Metalloproteinase MMP-2 zurückzuführen sind. Ferner führte die Expression von CEACAM1-4L zu einer gesteigerten MMP-14-vermittelten Freisetzung von MICA und einer daraus resultierenden Verringerung der Oberflächenexpression dieses NKG2D Liganden. Immunfluoreszenzanalysen wiesen eine Isoform-spezifische Lokalisation der CEACAM1 Spleißvarianten nach. Es zeigte sich, dass die CEACAM1-4 Varianten vor allem auf der Zelloberfläche lokalisiert sind, während die CEACAM1-3 Varianten hauptsächlich in zytoplasmatischen, vesikulären Strukturen detektiert wurden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte ich erstmals zeigen, dass die CEACAM1 Isoformen sowohl klinisch als auch biologisch antagonistische Effekte in Melanomzellen ausüben, wobei ich weiterhin zeigen konnte, dass entgegen vorheriger Annahmen, die Anzahl der extrazellulären Domänen regulatorische Einflüsse auf die Signalweiterleitung von CEACAM1 haben. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen wesentlich zu einem besseren Verständnis über die Funktion der unterschiedlichen CEACAM1 Spleißvarianten bei, welches essentiell ist, um die Sicherheit und Effizienz von neuen, potentiellen CEACAM1-basierenden Therapieansätzen zu gewährleisten.

Malignant Melanoma is the most aggressive skin cancer which arises from pigmented cells (melanocytes) located in the skin. Deregulation of cell adhesion molecules, like CEACAM1, has been shown to be essential for metastatic spread the leading course of death. It has been shown that expression of the cell adhesion molecule CEACAM1 enhances the melanoma cell motility and correlates with the development of metastatic disease. CEACAM1 is not expressed by melanocytes but in the majority of all melanoma. Thus, novel CEACAM1 anti-melanoma therapies are currently being investigated. Four different splice variants of CEACAM1 have been shown to be expressed in human tissue. Nevertheless no comprehensive studies exist, analyzing the clinical and biological role of these isoforms so far. The CEACAM1-4L, CEACAM1-4S, CEACAM1-3L and CEACAM1-3S isoforms are generated by alternative splicing of CEACAM1, whereas these isoforms differ in number of their extracellular domains and length of their cytoplasmic domain. This study shows for the first time that all four CEACAM1 isoforms are expressed in malignant melanoma, whereby the expression of the CEACAM1-3S variant correlates with patient clinical stage and results in prolonged patient overall survival. Analyses of specific CEACAM1 isoform transfectants implicated that the prolonged overall survival could be caused by reduced cell motility and enhanced immunogenicity of CEACAM1-3S expressing melanoma cells. This study shows for the first time that CEACAM1-3S reduces the migratory and invasive capacity but also inhibit the anchorage independent growth of melanoma cells. Furthermore, CEACAM1-3S increases the surface expression of MICA, ULBP2 and CD155, all ligands for the activating NK cell receptors NKG2D and DNAM-1. As a consequence thereof an increased NK cell-mediated lysis of CEACAM1-3S transfected melanoma cells could be detected. Furthermore, analyses of the remaining CEACAM1 isoforms showed that CEACAM1 splice variants act in an antagonistic fashion. I could show that CEACAM1-4L and CEACAM1-4S enhances the migratory and invasive capacity, whereby this was probably mediated by enhanced MMP-2 activities, shown at least for CEACAM1-4L. Furthermore, the presented data indicate that CEACAM1-4L downregulates cell surface levels of the NKG2D ligands MICA and ULBP2 by enhanced shedding, thereby promoting malignant phenotype. Immunofluorescence analysis revealed an isoform specific cellular localization for CEACAM1 splice variants. Here, it was shown that CEACAM1-4L and CEACAM1-4S is predominately localized at the cell surface, while CEACAM1-3 isoforms were mainly detected in vesicular-like structures, accumulated around the nucleus. The presented study shows for the first time that CEACAM1 isoforms have different, in parts antagonistic, clinical and biological functions in malignant melanoma. Herein, it was shown that the extracellular domains of CEACAM1 have also an impact on the signal transduction of CEACAM1.This study significantly contributed to a better understanding of the functional relevance of the different CEACAM1 isoforms in melanoma, which is essential to ensure the safety and efficiency of novel CEACAM1-based anti-melanoma immunotherapies.

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Ullrich, Nico: Evaluierung der klinischen und biologischen Relevanz von CEACAM1 Spleißvarianten im malignen Melanom. 2015.

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