Untersuchung des Metabolismus und der Pharmakokinetik des neuen Triazens TriN2755 in einer klinischen Phase-I-Studie

Wegener, Tobias

Bei TriN2755 handelt es sich um ein neues Triazen. Wie andere Vertreter dieser Substanzklasse ist es in der Lage einzelne DNA-Basen zu methylieren und über diesen Weg Apoptose zu induzieren. Da bisher noch keine Daten über die Verabreichung an menschlichen Patienten existierten, wurde zur Untersuchung der Sicherheit und Verträglichkeit eine Phase-I-Studie mit 38 Patienten durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Pharmakokinetik von TriN2755 zu beschreiben und den aufgrund der präklinischen Untersuchungen erwarteten Metabolismus, von dem bereits TriN2755 und neun weitere Verbindungen bekannt waren, zu verifizieren. Zu diesem Zweck wurde eine Methode zur Aufreinigung der Plasma- und Urinproben und eine sich daran anschließende HPLC-Analytik entwickelt und validiert. Die Detektion erfolgte simultan mit einem Photo-Dioden-Array und einem Massenspektrometer, das die Quantifizierung im einstelligen Nanogrammbereich ermöglichte. Bei einer initialen in vitro Inkubation von humanen Leukozyten eines gesunden Spenders mit TriN2755 wurden entstehende DNA-Addukte nach thermischer Hydrolyse ebenfalls per HPLC getrennt und fluorimetrisch detektiert. Außer einem mit der Zeit zunehmenden N7-Methylguaninanteil, konnten keine weiteren Addukte nachgewiesen werden. Die Untersuchung der dabei entstandenen Metaboliten lieferte vor allem Comp5 und Imp7 und deutete gleichzeitig auf die langsame Umsetzung der Triazene zu ihren inaktiven Abbauprodukten hin, da auch am Ende der Inkubation noch große Mengen TriN2755 vorhanden waren. Die an der Studie teilnehmenden Patienten erhielten TriN2755 als vierstündige Dauerinfusion. Die absolute Dosis wurde im Verlauf der Studie von 25mg auf 6000mg TriN2755 angehoben. Über einen Zeitraum von 26 Stunden nach Infusionsstart wurden pro Patient 14 Plasmaproben und alle in dieser Zeit anfallenden Urinproben gesammelt. Im Rahmen der durchgeführten Studie wurden so insgesamt 514 Plasmaproben sowie 352 Urinproben analysiert. Als Hauptmetaboliten des Phase-I-Metabolismus wurden Comp5 und Comp4 identifiziert. Aus den Messdaten wurden für TriN2755, Comp5 und Comp4 alle zugänglichen pharmakokinetischen Parameter berechnet. Ein statistischer Zusammenhang zwischen dem Geschlecht der Patienten und den berechneten Maximalkonzentrationen sowie den Flächen unter den Kurven konnte nicht bestätigt werden. Bei der Verabreichung von mehr als 800mg TriN2755 konnte ein Wechsel von linearer zu nicht-linearer Pharmakokinetik gezeigt werden. Im Zuge der Auswertung wurden über den Vergleich von unbekannten Absorptions- und Massenspektren mit denen der Referenzsubstanzen weitere Metaboliten identifiziert. Das bereits bekannte Schema zum Metabolismus von TriN2755 konnte so von 10 auf insgesamt 26 Verbindungen erweitert werden. Insbesondere wurden viele Phase-II-Metaboliten entdeckt, bei denen es sich um teils N-acetylierte Sulfate und Glucuronide der bereits bekannten Metaboliten Imp2 und Imp10, handelte. Der Metabolismus sowie die Pharmakokinetik von TriN2755 sind damit weit komplexer als ursprünglich vermutet. Einige der Metaboliten verfügen noch immer über die Triazenfunktion, unterliegen aber insgesamt sehr viel weniger metabolischen Umwandlungen als TriN2755 selbst. In weiteren Untersuchungen sollte daher geklärt werden, ob es sich bei diesen Substanzen um potenzielle klinische Kandiaten handelt, die in ihren pharmakokinetischen Eigenschaften TriN2755 sogar überlegen sind.

TriN2755 is a novel triazene. Like other agents of this substance class it has the ability to methylate DNA bases which leads to apoptosis. Since there was no data concencering the administration to human subjects, a Phase I clinical trial with 38 subjects was conducted which should assess safety and tolerance to TriN2755. The aim of this present work was to investigate the pharmacokinetics of TriN2755. Based on results of the preclinical research, a flow chart for TriN2755 and its already known metabolites was created which had to be verified. For this purpose a method to clean up plasma and urine samples was established. Subsequent HPLC analytics using both photodiode array and mass spectrometric detection with sensivity in the range of nanograms was set up and validated. A preceding in vitro incubation of human leukocytes from a healthy donor with TriN2755 was performed to analyse formed DNA adducts. Following thermal hydrolysis DNA adducts were analysed using HPLC with fluorometric detection. Continuous incubation led to rising N7-methylguanine levels but no other adduct could be detected. Analysis of metabolites that were formed during incubation yielded primarily Comp5 and Imp7 and implied slow conversion of triazenes to their inactive decomposition products as high concentrations of TriN2755 remained at the end of incubation period. Throughout the trial, the absolute dose of TriN2755 was increased from 25mg to 6000mg. Following the start of infusion 14 plasma samples and every urine sample were collected in a 26 hour time window. 514 plasma samples and 352 urine samples were collected and analysed this way. Comp5 and Comp4 were identified to be the primary metabolites during Phase I metabolism. Measured data was then used to calculate all accessible pharmacokinetic parameters. No statistical connection between the subjects’ gender and calculated maximum concentrations or areas under the curve could be found. After administration of more than 800mg TriN2755 a change in pharmacokinetics from linear to non-linear was shown. New metabolites were identified by comparing absorption and mass spectra of unidentified peaks with reference data. The original flow chart that covered TriN2755 and 9 of its metabolites was expanded to 26 compounds in total. Notably a lot of Phase II metabolites which turned out to be derivatives of Imp10 and Imp2 were found. These were either sulfate or glucuronide conjugates that additionally could be N-acetylated. Metabolism and pharmacokinetics of TriN2755 seemed to be far more complex than expected. Some of these metabolites still bear a triazene moiety but were not metabolized that excessiv. Further investigations should therefore examine if one of these metabolites can also become a clinical candidate which might be even superior to TriN2755.

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Wegener, Tobias: Untersuchung des Metabolismus und der Pharmakokinetik des neuen Triazens TriN2755 in einer klinischen Phase-I-Studie. 2015.

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