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Liquid Chromatography coupled to Isotope Ratio Mass Spectrometry of Selected Polar Compounds

Kujawinski, Dorothea

The analysis of light stable isotopes of organic compounds is nowadays a common tool in almost all fields of science. Geochemistry, archeology, product authenticity and ecology are only a few examples of the applicability of isotope ratio mass spectrometry. In this context it can answer questions regarding the botanical or synthetical origin of a sample constituent or help to reveal reaction mechanisms. However, due to several instrumental challenges there is still a need for analytical methods to determine compound-specific isotope ratios of thermolabile and non-volatile substances. Hence, many compound classes have not yet been studied using isotope ratio techniques. Thus, the work presented herewith focuses on the development of liquid chromatographic methods which can be used in combination with isotope ratio mass spectrometry. As analytes several sulfonamide drugs, trimethoprim and the herbicide glyphosate along with its metabolite aminomethylphosphonic acid were chosen. The developed methods were used to study environmentally relevant degradation mechanisms of these compounds. In the first part of the work, a high temperature liquid chromatography method was developed for the analysis of sulfadiazine, sulfathiazole, sulfametazine, sulfamethoxazole and trimethoprim. By the application of a high temperature gradient to a pure aqueous eluent for separation, all these compounds were fully resolved from each other on an octadecyl stationary phase. The lowest amounts necessary for a precise carbon isotopic analysis varied between 0.3 to 0.5 µg on column depending on the investigated substance. A repeatable offset of isotope ratios of 1.6 to 3.6 ‰ on the δ-scale has been observed and a careful investigation revealed an incomplete conversion of the analytes to the measured gas CO2 causing this offset. Additionally, it could be shown that the observed offsets could be corrected to obtain unbiased isotopic signatures. The applicability of the method was shown by the analysis of pharmaceutical products containing trimethoprim and sulfamethoxazole and direct photolysis of sulfamethoxazole. It was shown that the isotopic fractionation of this important degradation process is very low, slightly above the overall analytical precision, and is probably based on a secondary inverse isotope effect. The other compounds studied in this work were glyphosate, one of the most widely used herbicides world-wide and its metabolite aminomethylphosphonic acid. For the analysis of these compounds ion exchange and reversed phase chromatography on a porous graphitic carbon column were investigated. The latter separation mode yielded the best separation of glyphosate and aminomethylphosphonic acid. Fractionation factors for the chromatographic separation could be calculated and it was shown that a carbon isotope effect associated with anion exchange is not detectable, while in contrast a carbon isotope substitution produces a very small but observable secondary isotope effect in the cation exchange of an amine group. Since these fractionation factors are very small, it can be concluded, that adsorption of glyphosate to soil resulting from van der Waals interactions and ion exchange will not change its carbon isotope ratio significantly. One of the developed methods, a reversed-phase chromatography on porous graphitic carbon, was used to study the isotopic fractionation of the degradation of glyphosate by manganese dioxide. The observed fractionation factor of about -3.5 ‰ was too big to originate from adsorption to the mineral surface. It was concluded that two reaction pathways lead to the cleavage of glyphosate and the observed isotope effect is a sum of both. A comparison with the calculated maximum isotope effect (Streitwieser limit) showed that other factors than zero point energy differences, such as differences in symmetry and mass moments of inertia, govern the isotopic fractionation of this reaction. Since there was no change in δ13C values of AMPA, it was concluded that the origin of this unspecific degradation product in the environment may be traced in future. Therefore, the last chapter of this work aimed to develop a method to determine position specific carbon isotope ratios of glyphosate, as this is a requisite in tracing the origin of AMPA. Besides, such a method might be useful for product authenticity control of glyphosate herbicide formulations. Two approaches, nuclear magnetic spectroscopy and an enzymatic cleavage followed by liquid chromatography isotope ratio mass spectrometry of the fragments, were chosen. However, it was not possible to determine accurate and precise carbon isotope ratios mainly due to non-linear response in nuclear magnetic resonance spectroscopy and unfavorable reaction conditions for the enzymatic cleavage. The chromatographic methods developed in this work enabled new insights on reaction pathways of glyphosate and sulfamethoxazole and will certainly be used in further investigations on these substances. But there is still work necessary to extend the application field of LC-IRMS to other important compounds and elements.

Heutzutage ist die Analyse von Stabilisotopenverhältnissen organischer Stoffe in fast allen Forschungsgebieten vertreten. Einige Beispiele dafür sind Geochemie, Archäologie, Ökologie sowie die Produktauthentifizierung. Durch die Isotopenverhältnismassenspektrometrie können wirtschaftlich bedeutende Fragen der botanischen oder synthetischen Herkunft eines Produktes beantwortet werden. Zudem ist es unter anderem möglich, Reaktionsmechanismen zu identifizieren. Aufgrund instrumenteller Anforderungen gibt es trotz der vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten nur wenige flüssigchromatographische Methoden, um komponentenspezifische Isotopenverhältnisse von nichtflüchtigen und thermolabilen Stoffen zu bestimmen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, flüssigchromatographische Methoden für Sulfonamid- und Trimethoprimantibiotika sowie für das Herbizid Glyphosat und seinen Hauptmetaboliten Aminomethylphosphonsäure zu entwickeln. Diese Methoden sollten eine komponentenspezifische Kohlenstoffisotopenanalyse ermöglichen, mit der ausgewählte umweltrelevante Abbauprozesse dieser Verbindungen untersucht wurden. Die ersten zwei Kapitel befassen sich mit den Sulfonamidantibiotika Sulfadiazin, Sulfathiazol, Sulfametazine, Sulfamethoxazol und dem wirkungsverwandten Trimethoprim. Zuerst wurde eine Hochtemperaturflüssigchromatographie dieser Stoffe entwickelt, mit der alle Analyten vollständig auf einer Oktadekyl-Säule mit Hilfe eines rein wässrigen Eluenten getrennt werden können. Die kleinste Menge, die zur präzisen Messung benötigt wird, betrug je nach Substanz 0,3 bis 0,5 µg absolut. Ein beobachteter Offset der Kohlenstoffisotopenverhältnisse war substanzabhängig und lag zwischen 1,6 bis 3,4 ‰ auf der δ-Skala. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Offset von einer unvollständigen Oxidation der Stoffe herrührte. Zudem war eine Korrektur der beobachteten Offsets möglich, sodass biasfreie Isotopenverhältnisse erhalten werden konnten. Die Anwendbarkeit der Methode wurde durch die Analyse von pharmazeutischen Kombinationspräparaten bestehend aus Sulfamethoxazol und Trimethoprim und der direkten Photolyse von Sulfamethoxazol unter UV-Einstrahlung in wässriger Lösung gezeigt. Der Isotopeneffekt dieser Reaktion war sekundär, invers und relativ klein. Das folgende Kapitel beinhaltet die chromatographische Methodenentwicklung für das Herbizid Glyphosat und seinen Metaboliten Aminomethylphosphonsäure. Drei verschiedene Trenntechniken, Umkehrphasenchromatographie, Kationen- und Anionenaustauschchromatographie, wurden auf ihre Anwendbarkeit in der Kohlenstoffisotopenanalyse verglichen. Dabei zeigte sich, dass die Umkehrphasenchromatographie auf einer stationären Phase aus porösen Graphitpartikeln eine bessere Trennung von Glyphosat und Aminomethylphosphonsäure erreicht als Ionenaustauschmethoden. Aus den chromatographischen Daten der Methodenentwicklung konnten Fraktionierungsfaktoren für Glyphosat und Aminomethylphosphonsäure berechnet werden. Es hat sich gezeigt, dass kein Kohlenstoffisotopeneffekt bei Anionenaustausch, jedoch ein sekundärer Kohlenstoffisotopeneffekt bei Kationenaustausch einer Aminogruppe messbar ist. Aus der Größe der Fraktionierungsfaktoren kann geschlossen werden, dass die Sorption dieser Stoffe im Boden resultierend aus Ionenaustausch oder van-der-Waals-Wechselwirkungen die Kohlenstoffisotopenverhältnisse nicht signifikant ändert. Mithilfe der entwickelten Trennmethode wurde im folgenden Kapitel der abiotische Abbau von Glyphosat durch Mangandioxid auf einen messbaren Isotopeneffekt hin untersucht. Diese Reaktion zeigte eine Fraktionierung, die auf eine Mischung der Kohlenstoffisotopeneffekte zweier Reaktionswege zurückgeführt wurde. Neben dem erwarteten Produkt Sarkosin, wurde auch Aminomethylphosphonsäure detektiert. Ein Vergleich mit berechneten Isotopeneffekten (Streitwieser Grenzen) zeigte, dass andere Faktoren als Nullpunktsenergiedifferenzen, wie Unterschiede in der Symmetrie oder Trägheitsmomenten die Größe des Isotopeneffektes bestimmen. Zudem zeigte die Untersuchung der Kohlenstoffisotopenverhältnisse der Reaktionsprodukte, dass dieser Abbauweg von Glyphosat keinen Einfluss auf die δ13C-Werte von Aminomethylphosphonsäure hat. Dadurch könnte in Zukunft das Auftreten von Aminomethylphosphonsäure in Umweltproben auf Glyphosat-Abbau zurückführbar sein, da dieser Stoff auch aus dem Abbau anderer Phosphonate entstehen kann. Eine Voraussetzung dafür ist jedoch, dass auch positionsspezifische δ13C-Werte von Glyphosate bestimmt werden können. Daher war das Ziel des letzten Kapitels dieser Arbeit, eine Methode zur Bestimmung von Kohlenstoffisotopenverhältnisse von Glyphosat an der P-C Position zu erarbeiten. Dafür wurden die magnetische Kernresonanzspektroskopie der 13C-Satellitenlinien und eine mangankatalysierte Enzymreaktion gefolgt von der FlüssigchromatographieIsotopenverhältnismassenspektrometrie der erhaltenen Fragmente ausgesucht. Aufgrund fehlender Linearität des Detektors der magnetische Kernresonanzspektroskopie und ungünstigen Reaktionsbedingungen lieferten jedoch beide Methoden keine verwertbaren Ergebnisse. Durch die chromatographischen Methoden, die während dieser Arbeit entwickelt wurden, konnten neue Erkenntnisse zu Abbauwegen von Sulfamethoxazol und Glyphosate gewonnen werden. Diese Methoden werden sicherlich auch in kommenden Arbeiten zum chemischen Verhalten dieser Stoffe zum Einsatz kommen.

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Kujawinski, Dorothea: Liquid Chromatography coupled to Isotope Ratio Mass Spectrometry of Selected Polar Compounds. 2014.

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