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Genetic heterogeneity of virus isolates in chronic hepatitis C patients infected in a single-source HCV outbreak : special structural features and evidences that both humoral and cellular immune responses contribute to evolution of the envelope 2 viral protein

Lipskoch, Maren

The specific anti-viral immune response of the host is considered as one of the major factors of HCV genome evolution. Adaptation of the virus to both cellular and humoral immune pressures by selection of the escape mutations in the targeted B- and T- epitopes is the basic mechanism of the evolution. Many details of HCV adaptation to selective forces, both in individual patients and, especially at the population level, are not completely clear. The current study address several aspects of this issue and its major aim was to get an insight into the evolution of the HCV genome at a population level and, in particular, into the contribution of humoral and cellular immune responses to evolution of the HCV envelope protein E2. Many investigations of HCV evolution were hampered by the absence of information on the viral ancestral genomic sequence. The essential characteristic of the current project was the use of a special group of patients – women infected with the same HCV AD78 strain via contaminated anti-D globulin in a single-source outbreak. This allowed performing the accurate analysis of viral evolution at a population level using the HCV AD78 sequences present in the anti-D globulin as the index founder sequences. At the first stage of the project a sequence database (core-P7 and NS4-NS5 genomic fragments) for multiple isolates of the HCV AD78 strain obtained from 93 anti-D patients persistently infected for 30 years and from contaminated immunoglobulin was generated. Availability of this database allowed to analyze in detail the heterogeneity of the infectious source of the anti-D outbreak and to establish a potential time point of separation of the original HCV AD78 strain into the three closely related variants. This led to the establishment of the consensus sequences for 3 variants of the HCV AD78 strain. These sequences have been used in collaboration with the group of R.Bartenschlager for generation of the novel chimeric AD78/JFH1 viruses, which were capable to replicate in Huh7.5 hepatoma cells to high levels. Availability of such robust cell culture system represents an important step in the extension of the currently available JFH1-based systems of genotype 1. Especially promising are these new chimeric viruses for studies based on the materials from the HCV AD78 outbreak. In particular, this system is essential for elucidation of the biological significance of the mutations occurring in viral genome during both acute and persistent phases of infection. Analysis of the heterogeneity of HCV AD78 sequences from anti-D patients has demonstrated a number of mutations both inside and outside of the CD8 T-cell epitopes and antiviral antibody binding sites and regions. Both reverse (toward the consensus 1b sequence) and forward (away from the infecting inoculum sequence) mutations were present with a predominance of the latter. A large number of mutations inside the CD8 epitopes were remarkably stable over 30 years of persistence. A least some of them were real escape mutations that, most probably, were preserved due to appearance of the compensatory mutations. The analysis of the frequency of mutations inside and outside of known and putative B- and T-cell epitopes within the E2 protein from AD78 isolates has shown higher rates of nonsynonymous amino acid substitutions inside the B-cell epitopes and, to a lesser extent inside the CD8 epitopes, than outside of these epitopes, suggesting that both humoral and CD8 T-cell immune responses contribute to the E2 evolution during the long-term HCV persistence. At that, the humoral response probably plays a leading role, while the contribution of the CD8 T-cell response seems to be less profound. Application of a statistical approach allowed for identification of three putative novel CD8 T- cell epitopes in the core, E2 and NS2 proteins; one of them was confirmed by a functional assay in vitro. In several known CD8 epitopes an association between expression of different HLA class I alleles and presence of particular polymorphic sites was reproducibly found, suggesting immune pressure at the population level. Introduction of several escape mutations, identified in the core and E2 proteins, into the genome of the HCVcc constructs has impaired virus replication confirming that these were truly escape mutations. For the HLA-B51-specific mutation H153Q a reduction of the infectious titers depended very much on the origin of the sequence included into the HCVcc genome. This mutation caused relatively mild impairment of the infectivity of the AD78/JFH1 virus, while in the H77/JFH1 virus it led to a dramatic loss of infectivity exceeding 6 logs. These data indicate that the impact of the escape mutations on viral fitness to a significant extent might depend on the sequence context. Generation of the HCV AD78 sequence database also allowed identifying a peculiar structural feature of some HCV strains - presence of additional 1 to 5 amino acid residues at the N- terminus of the E2 protein. Most of the AD78 isolates demonstrate the presence of such inserts. Both the HCVcc system and the HCVpp–based approach were used for analysis of the influence of the additional amino acid tracks on virus infectivity and replication. Presence of such inserts in the HCVpp bearing the AD78E1/E2 sequence or in the AD78/JFH1 virus has not significantly changed the infectivity of virus particles. In contrast, the insertion of the same additional stretches into the H77/JFH1 virus, which bears the structural genes of the H77 subtype 1a strain, caused a complete abolishment of infectivity. Analysis of the composition of these additional amino acid stretches has shown a high prevalence of small and flexible residues, which might facilitate the maintenance of the varied conformational states of the HVRI. That, in turn, could affect some functional characteristics of the E2 protein, including its antigenic properties and ability to recognize and bind to HCV cell receptors.

Die spezifische, antivirale Immunantwort des Wirtes stellt einen der Hauptfaktoren für die Evolution des HCV Genoms dar. Die Anpassung des Virus an den zellulären und humoralen Selektionsdruck erfolgt über die positive Selektion von „escape“-Mutationen in B- und T-Zell Epitopen und stellt den Basismechanismus der HCV Evolution dar. Viele Aspekte, die besonders auf Populationsebene zur Adaption von HCV an selektive Einflüsse führen, sind noch nicht ausreichend untersucht. Die vorliegende Studie befaßt sich mit einigen dieser Aspekte, wobei das Hauptziel in der Untersuchung der Evolution des HCV Genomes auf Populationsebene lag. Besonders der Beitrag der humoralen und zellulären Immunantwort zur Evolution des HCV Hüllproteins E2 wurde untersucht. Viele Ansätze, die sich bisher mit der Evolution von HCV beschäftigten, waren relativ eingeschränkt, da keine Informationen über die ursprüngliche Sequenz des Inokulums vorlagen. Eine große Besonderheit der vorliegenden Studie ist die Untersuchung einer einzigartigen Patientengruppe - Frauen, die mit demselben HCV AD78 Stamm durch Verabreichung eines HCV kontaminierten anti-D Immunglobulins in einem „single-source“-Ausbruch infiziert wurden. Durch den Zugang zu verschiedenen Materialien dieser Kohorte war eine detaillierte Analyse der viralen Evolution auf Populationsebene möglich, wobei die AD78 Sequenzen im kontaminierten Immunglobulin als Indexsequenzen dienten. Im ersten Schritt des Projektes wurde eine Sequenzdatenbank (core-NS2 und NS4-NS5 Genomregion) für multiple Isolate des HCV AD78 Stammes von 93 Patienten erstellt, welche persistierend über einen Zeitraum von 30 Jahren mit HCV AD78 infiziert waren, sowie von Sequenzen aus dem kontaminierten Immunglobulin. Mit Hilfe der erstellten Sequenzdatenbank konnte die Heterogenität der Infektionsquelle des anti-D Ausbruchs detailiert analysiert werden und ein potenzieller Zeitpunkt der Separation des original AD78 Stammes in die drei eng verwandten Varianten konnte festgelegt werden. Außerdem konnten die Konsensusequenzen für alle drei AD78 Varianten erstellt werden, auf deren Grundlage in Kollaboration mit Prof. R. Bartenschlager die neuen AD78/JFH1 Viruschimären generiert wurden. Diese neuen chimären Konstrukte waren in der Lage, erfolgreich in Huh7.5 Zellen zu replizieren. Die Verfügbarkeit dieses neuen und robusten Zellkultursystems stellt einen bedeutenden Schritt für die Erweiterung der bisher kreierten JFH1- basierten Genotyp 1b Systeme dar. Besonders geeignet sind diese neuen Viruschimären für Studien, die sich mit Proben des HCV AD78 Ausbruchs befassen. Dieses neue System stellt ein essentielles Hilfsmittel für die Aufklärung der biologischen Signifikanz von Mutationen, die im viralen Genom während der akuten und persistierenden Phase der Infektion auftreten, dar. In der Analyse der Heterogenität von HCV AD78 Sequenzen aus anti-D Patienten wurden verschiedene Mutationen innerhalb und außerhalb von CD8 T-Zell-Epitopen und Bindungsstellen für neutralisierende Antikörper identifiziert. Mutationen weg von der Inokulumsequenz (forward mutations) wurden dabei häufiger detektiert als Mutationen in Richtung der allgemeinen 1b Konsensusequenz (reverse mutations). Eine große Anzahl von Mutationen innerhalb von CD8 T-Zell-Epitopen zeigte sich als bemerkenswert stabil in einem Zeitraum von 30 Jahren Persistenz. Einige von diesen Mutationen waren echte „escape“ Mutationen und wurden durch das Auftreten von kompensatorischen Mutationen in der Population fixiert. Die Analyse der Frequenz von Mutationen innerhalb und außerhalb von bekannten und putativen B- und T-Zell-Epitopen im E2 Protein aus AD78 Isolaten zeigte eine höhere Rate nonsynonymer Aminosäuresubstitutionen innerhalb von B-Zell-Epitopen und weniger ausgeprägte nonsynonyme Mutationen innerhalb von CD8 T-Zell-Epitopen. Diese Mutationen konnten vermehrt innerhalb bekannter Epitope beobachtet werden, als außerhalb dieser Epitope, was daraufhin deutet, dass sowohl die humorale als auch die zelluläre Immunantwort zur Evolution des E2 Hüllproteins in der langzeit-persistierenden HCV Infektion beitragen. Desweiteren scheint die humorale Immunantwort eine leitende Rolle in der Evolution des HCV E2 Proteins einzunehmen, wogegen die CD8 T-Zell Antwort einen geringeren Einfluß auf die Entwicklung des HCV E2 Proteins zu haben scheint. Die Anwendung eines statistischen Ansatzes ermöglichte die Identifikation von drei putativen neuen CD8 T-Zell-Epitopen im core, E2 und NS2 Protein. Eines der potenziellen neuen Epitope konnte mittels funktionellem in vitro Zellkultur-Assay verifiziert werden. Innerhalb einiger bekannter CD8 T-Zell-Epitope konnte reproduzierbar eine Assoziation zwischen Expression eines bestimmten HLA Klasse 1 Allels und dem Auftreten bestimmter Polymorphismen an definierten Positionen hergestellt werden, was auf eine Immunselektion auf Populationsebene hindeutet. Die Einführung verschiedener „escape“ Mutationen, die in der core- und E2-Region identifiziert wurden, in das Genom von HCVcc Konstrukten führte zu einer Beeinträchtigung der Virusreplikation und Infektion. Diese Daten bestätigen, dass die beobachteten Polymorphismen tatsächlich „escape“ Mutationen waren. Im Falle der HLA-B51 spezifischen Mutation H153Q zeigte sich eine Reduktion des infektiösen Virustiters in Abhängigkeit der Herkunft der Sequenz, die in das HCVcc Genom integriert wurde. Während diese Mutation im AD78/JFH1 System zu einer sehr milden Beeinträchtigung der Infektiosität führte, wurde durch Einführung dieser Mutation in das H77/JFH11 System die Infektiosität dramatisch reduziert (> 6 logs). Diese Daten lassen darauf schließen, dass der Einfluß von „escape“ Mutationen auf die virale Fitness zu einem großen Teil vom Sequenzkontext abhängig sein kann. Durch die Erstellung der HCV AD78 Sequenzdatenbank war es möglich eine strukturelle Besonderheit einiger HCV Stämme zu identifizieren, nämlich das Vorhandensein von zusätzlichen 1 - 5 Aminosäuren am N-Terminus des E2 Proteins. Die meisten der AD78 Isolate wiesen solche Insertionen auf. Mit Hilfe des HCVpp und HCVcc Systems wude der Einfluß dieser zusätzlichen Aminosäuren auf die virale Replikation und Infektion untersucht. Insertion dieser zusätzlichen Aminosäuren in das HCVpp System, basierend auf AD78 E1/E2 Sequenzen, und das AD78/JFH1 HCVcc System hatte keinen signifikanten Einfluß auf die Infektiosität dieser Partikel. Im Gegensatz dazu führte die Insertion der gleichen zusätzlichen Aminosäuren in das H77/JFH1 HCVcc System zu einem vollständigem Verlust der Infektiosität. Die genaue Analyse der zusätzlichen Aminosären zeigte auf, daß bevorzugt kleine, flexible Aminosären vorkommen, welche zum Erhalt der konformationellen Variabilität der HVR1 beitragen könnten. Dies wiederum könnte einige funktionelle Charakteristika des E2 Proteins, einschließlich seiner Antigeneigenschaften und Fähigkeit HCV Zellrezeptoren zu erkennen und zu binden, beeinflussen.

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Lipskoch, Maren: Genetic heterogeneity of virus isolates in chronic hepatitis C patients infected in a single-source HCV outbreak. special structural features and evidences that both humoral and cellular immune responses contribute to evolution of the envelope 2 viral protein. 2014.

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