The functional relationship between Inhibitor-3, SDS22, and PP1 in the process of bipolar spindle attachment
The identification of bipolar kinetochore-microtubule attachments is essential for proper progression through mitosis. This is achieved by dynamic Aurora B-mediated phosphorylation of its targets at the kinetochore. Centromere-localized Aurora B phosphorylates kinetochore proteins in a tension-dependent manner, thereby destabilizing wrong kinetochore-microtubule attachments, which are without tension. PP1-mediated dephosphorylation of Aurora B substrates at kinetochores, which are under tension and thereby pulled out of the reach of Aurora B, leads to stabilization of kinetochore-microtubule attachments. Targeting of PP1 to the kinetochore by KNL1 and SDS22 (as well as CENP-E and KIF18A) is thought to regulate PP1 activity at the kinetochore in mammalian cells. However, the exact mechanism of PP1 regulation by SDS22 remained unclear so far, as contradictory data exist concerning the kinetochore-localization of SDS22 and its relevance for the activity of Aurora B on metaphase chromatin. Furthermore, in yeast, also Iinhibitor-3 (I3), which builds a trimeric complex with PP1-SDS22, is known to be relevant for PP1-mediated counteraction of the Aurora kinase.
In this thesis, we resolved the contradictory data, published on SDS22 and we provided additional information, which clarifies its role in PP1 regulation. Furthermore, we elucidated the function of I3 in mammalian cells. Our data demonstrate that SDS22 does not localize to kinetochores quantitatively and also does not function as a targeting subunit of PP1. Moreover, we find that SDS22 is required for PP1-mediated counteraction of Aurora B activity. However, increased levels of SDS22 at kinetochores inhibit PP1 activity. From these data we conclude that SDS22-bound PP1 is inactive, although SDS22 is required for PP1 activity. Therefore, we suggest that SDS22 may act as a general chaperone, stabilizing inactive PP1 for re-activation. Furthermore, we show for the first time that I3 is required for proper chromosome congression and PP1-mediated counteraction of Aurora B in mammalian cells. Our data indicate that I3 ensures localization of active PP1 to KNL1 by restricting SDS22 localization to KNL1-bound PP1. Increased SDS22 localization to kinetochore-bound PP1 due to I3 knockdown causes not only metaphase defects, but also leads to anaphase defects and persistence of active Aurora B on anaphase chromatin. Additionally, our data provide initial hints that the mechanism of PP1-SDS22 sequestration by I3 could be regulated via phosphorylation of I3 during mitosis. Finally, investigating the function of I3 and SDS22 provides a basis for exploring the functional link between I3-PP1-SDS22 and p97-p47/p37, which were found to interact physically.
Die Bildung und Identifikation von bipolaren Kinetochor-Mikrotubuli-Verbindungen ist essentiell für den erfolgreichen Verlauf der Mitose. Beides wird erreicht durch die Aurora B abhängige Phosphorylierung von Kinetochor-Proteinen. Am Zentromer lokalisiertes Aurora B phosphoryliert seine Kinetochor-lokalisierten Substrate wenn Kinetochor-Mikrozubuli-Verbindungen nicht unter Spannung stehen. Dadurch wird erreicht, dass falsche Kinetochor-Mikrotubuli-Verbindingungen, die nicht unter Spannung stehen, destabilisiert werden. Kinetochore, die durch bipolare Verbindung mit Mikrotubuli unter Spannung stehen, können von dem, am Zentromer lokalisierten, Aurora B nicht mehr erreicht werden, wodurch PP1-abhängige Dephosphorylierung der Kinetochor-Substrate favorisiert wird. Aufgrund von Experimenten in Säugerzellen wird angenommen, dass die Aktivität von PP1 am Kinetochor über dessen Lokalisierung durch SDS22 (als auch KNL1, CENP-E, und KIF18A) reguliert wird. Der genaue Mechanismus ist bisher jedoch ungeklärt, da widersprüchliche Daten bezüglich der Lokalisierung von SDS22 und des Einflusses von SDS22 auf die Aktivität von Aurora B publiziert wurden. Zusätzlich haben Experimente in Hefe gezeigt, dass auch Inhibitor-3 (I3), welches einen trimeren Komplex mit PP1 und SDS22 bildet, für das antagonistische Wechselspiel von PP1 und Aurora B benötigt wird.
In dieser Arbeit wurden die Widersprüche bezüglich der Lokalisierung und Funktion von SDS22 aufgeklärt, sowie weitere Erkenntnisse gewonnen, die neue Schlussfolgerungen über die Rolle von SDS22 auf PP1 erlauben. Des Weiteren wurde die Funktion von I3 in Säugerzellen aufgeklärt. Diese Ergebnisse zeigen, dass SDS22 nicht quantitativ an den Kinetochoren lokalisiert und es auch nicht die Lokalisierung von PP1 zu den Kinetochoren reguliert. Jedoch ist SDS22 für ein funktionierendes Wechselspiel von PP1 und Aurora B am Kinetochor essentiell, auch wenn sich eine erhöhte Lokalisierung von SDS22 an den Kinetochor inhibierend auf die Aktivität von PP1 auswirkt. Dies führt zu der Schlussfolgerung, dass SDS22-gebundenes PP1 inaktiv ist, trotzdem aber SDS22 für PP1 Aktivität benötigt wird, woraus sich die Hypothese ergibt, dass SDS22 die Funktion eines Chaperons zur Stabilisierung inaktiven PP1s übernimmt, welches zur Reaktivierung von inaktivem PP1 benötigt werden könnte. Desweiteren wird erstmalig gezeigt, dass auch I3 für die erfolgreiche Bildung einer Metaphase Platte und für ein funktionierendes Wechselspiel von PP1 und Aurora B in Säugerzellen erforderlich ist. Die Daten belegen zusätzlich, dass I3 die Bindung von aktivem PP1 an KNL1 durch die Restriktion der Lokalisierung von SDS22 an KNL1-gebundenes PP1 sichert. Eine Störung der Lokalisierung von SDS22 verursacht nicht nur Defekte in Metaphase, sondern auch in Anaphase, da Segregationsdefekte und persistierendes aktives Aurora B auf Anaphase Chromatin gefunden wurde. Die Ergebnisse liefern darüber hinaus erste Hinweise auf eine Regulierung I3 abhängiger Sequestrierung von PP1-SDS22 durch Phosphorylierung von I3 in Mitose.
Schließlich vereinfacht die Entschlüsselung der Funktionsweise von SDS22 und I3 die weitere Suche nach der funktionellen Verbindung zwischen den, physikalisch interagierenden Komplexen I3-PP1-SDS22 und p97-p47/p37.
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