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Entwicklung siRNA basierter Therapieansätze im Mausmodell am Beispiel viraler Hepatitiden

Real, Catherine Isabell

Die RNAi Technologie bietet einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von hepatischen Viruserkrankungen. Um einen sicheren Einsatz von siRNAs gewährleisten zu können, ist es notwendig, die hepatischen Wirkmechanismen von siRNA zu kennen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Beteiligung von endosomalen-MyD88-abhängigen Toll-like Rezeptoren an der siRNA-vermittelten Immunantwort in vivo nachgewiesen. Diese Immunantwort wurde durch die nicht-parenchymalen Leberzellen vermittelt und resultierte in der Expression verschiedener Zytokine. Auch in weiteren Organen wie Milz, Niere und Herz war eine Immunreaktion detektierbar. Durch chemische Modifikationen am Riboserückgrat der siRNA wie 2’O-Methyl oder 2’Fluor konnte diese immunologische Nebenwirkung unterbunden werden. Des Weiteren konnte im zweiten Abschnitt mittels der Isg15-siRNA gezeigt werden, dass der Einsatz von LNP01-formulierten siRNAs im Mausmodell zu einem Hepatozyten-spezifischen Knockdown führte. Die verschiedenen Ribose-Modifikationen hatten hierbei keinen signifikanten Einfluss auf die Effizienz der siRNAs. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die LNP01-Formulierung auch in einem humanisierten Mausmodell zur spezifischen Gensuppression in den humanen Hepatozyten führte, sowie zur Suppression der HCV-Replikation in vivo. Der etablierte, siRNA-vermittelte Knockdown des Wirtsfaktors Isg15 in vivo, ist eine Option in der HCV Therapie, da er die HCV-Replikation direkt supprimiert und zusätzlich zu einer verstärkten hepatischen Reaktion auf endogenes und exogenes Interferon alpha führte. In vitro zeigte sich die Kombination aus siISG15 und einem Protease-Inhibitor (PI) als effiziente Therapieoption in der HCV Behandlung, mit dem Vorteil, dass die Entstehung von Resistenzen gegenüber des PIs den Therapieerfolg weniger beeinflusst. Der dritte Teil dieser Arbeit nutzte den Isg15 Knockdown in vivo sowie in vitro im HCV-Replikon Modell, um die Bedeutung von Isg15 im Rahmen der HCV-Replikation aufzuklären. Die Proteomanalyse identifizierte verschiedene Proteine, welche von der Isg15 Expression abhängig waren, welche einen direkten Effekt auf die HCV-Replikation hatten (Hnrnp K und Hmgcs1) oder in den Lipid-Metabolismus und in den Zusammenbau der Viruspartikel (assembly) involviert waren. Psma6 wurde als negativ Regulator der Isg15 Expression identifiziert und scheint damit indirekt die HCV-Replikation zu beeinflussen. Die Anwendung von siRNA im HBV transgenen Mausmodell im letzten Abschnitt dieser Arbeit zeigte zum einen, dass siRNAs effiziente Werkzeuge sind, um die virale Replikation auch direkt zu hemmen. Zum anderen diente der Einsatz der siRNA der Untersuchung der HBV-induzierten Immunantwort. Es zeigte sich, dass in den HBVtg Tieren ohne HBsAg Expression eine konsistente TLR3-induzierte IFN/ISG Antwort vorlag. Auch die Expression von pro-viralen Wirtsfaktoren wie Hnrnp K und Hmgcs1 war erhöht. Die Tiere wiesen ein funktionelles TLR-System auf, jedoch war die TLR3- und TLR7-abhängige Immunantwort in den Tieren reduziert, aber nicht komplett inhibiert. Diese Arbeit zeigt das Anwendungsspektrum von siRNAs in vivo, sie können der Untersuchung von Virus-Wirts-Interaktionen, ebenso wie der therapeutischen Anwendung gegen virale Hepatitiden, dienen.

RNAi technology is a promising approach for the treatment of viral hepatitis. To ensure safety and efficacy of this technology, it is necessary to determine the hepatic off-target responses induced by siRNA. This study identified the involvement of endosomal MyD88-dependent Toll-like receptors in siRNA-induced immune responses in vivo. These immune responses were orchestrated by the non-parenchymal liver cells (NPC) and resulted in the expression of different cytokines. In other organs like spleen, kidney and heart these immune reactions were detectable as well. These off-target effects could be avoided by chemical modifications of the ribose backbone of the siRNA, like 2’O-methyl or 2’ fluor modifications. Furthermore, it was shown that LNP01-formulated Isg15-specific siRNAs led to a hepatocyte-restricted knockdown in mice. The knockdown efficiencies were not impaired by the different ribose-modifications. Additionally, suppression of ISG15 in humanized, HCV-infected mice led to the suppression of HCV replication. The knockdown of this pro-viral host factor is a promising option for the future HCV therapy strategies, because it directly suppresses HCV replication and enhanced hepatic response to endogenous and exogenous Interferon alpha. The combination of siISG15 and a HCV protease inhibitor (PI) exhibits the advantage to prevent resistance development against the PI in vitro. The investigation of the Isg15 knockdown in vitro and in vivo revealed the enigmatic link between Isg15 and HCV. Proteome analysis identified different proteins which depend on the Isg15 expression, directly influenced the HCV replication (Hnrnp K and Hmgcs1) or were likely be involved in lipid metabolism and virus assembly. Psma6 was identified as a negative regulator of the Isg15 expression and may therefore influence the HCV replication indirectly. The application of siRNA in a HBV transgenic mouse model identified siRNAs as efficient tools to directly block viral replication. Additionally, the siRNAs were used to investigate immune response in these animals. It was shown, that the HBVtg mice lacking the HBsAg, exhibited consistent TLR3-dependent IFN/ISG responses. The expression of pro-viral host factors like Hnrnp K and Hmgcs1 was elevated as well. Furthermore, the animals showed a functional TLR system, here TLR3- and TLR7-dependent immune responses were reduced but not completely abrogated. In conclusion, this study showed a broad range of siRNA applications in vivo including the analysis of host virus interactions and direct therapeutic approaches against viral hepatitis.

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Real, Catherine Isabell: Entwicklung siRNA basierter Therapieansätze im Mausmodell am Beispiel viraler Hepatitiden. 2014.

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