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The role of the AAA+ -ATPase p97 in the regulation of cell cycle checkpoint activation in response to DNA damage

Riemer, Anne

Der Zellzyklus ist ein streng regulierter Prozess, welcher die exakte Replikation und Segregation des genetisches Materials in zwei Tochterzellen reguliert. Um einen geordneten Verlauf durch den Zellzyklus und damit der Bewahrung der genomischen Integrität zu gewährleisten, enthält der Zellzyklus in Säugetieren sogenannte Kontrollpunkte. Die Aktivierung der Zellzyklus Kontrollpunkte hängt dabei nicht nur von zahlreichen Phosphorylierungsereignissen ab, sondern auch vom koordinierten Abbau der Zellzyklus regulierenden Proteine durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS). Ein zentraler Regulator im Ubiquitin-Proteasome-System ist die AAA+-ATPase p97, welche ubiquitinierte Substrate erkennt und sie für den proteasomalen Abbau überführt. Zusammen mit dem Ko-Faktor Ufd1-Npl4, reguliert p97 zahlreiche Ereignisse innerhalb des Zellzyklus und beeinflusst dadurch den Fortschritt des Zellzyklus unter physiologischen Bedingungen als auch in Reaktion auf DNA Schaden. Die Depletierung von p97Ufd1-Npl4 führt zu schwerwiegenden Segregationsdefekten in der Mitose, welche nicht vollständig durch die Funktion von p97 in der Mitose erklärt werden können. Vielmehr kann eine Anzahl dieser Segregationsdefekte aus der Funktion von p97 in verschiedenen Interphase Prozessen resultieren. Daher versuchten wir im Rahmen dieser Arbeit die Relevanz der Interphaseprozesse, welche durch p97 reguliert werden, auf die Ausprägung von Segregationsdefekten in der Mitose zu untersuchen. Darüber hinaus untersuchten wir den molekularen Mechanismus des p97Ufd1-Npl4 Komplexes, welcher die Aktivität des G2/M Kontrollpunktes nach DNA Schaden in humanen, somatischen Zellen reguliert. In dieser Arbeit zeigen wir, dass p97 notwendig ist für die vollständige Aktivierung des G2/M Kontrollpunktes nach ionisierender Bestrahlung und den Eintritt in die Mitose in Anwesenheit von DNA Schaden und die daraus resultierende Ausprägung chromosomaler Instabilität verhindert. Die Depletion von p97Ufd1-Npl4 in bestrahlten Zellen führt zu einer Zunahme an Segregationsdefekten, die durch den Transfer von DNA Schäden in die Mitose entstanden sind. Durch die Analyse der Hauptregulatoren der DNA Schadensantwort, konnten wir einen verzögerten Abbau von CDC25A in p97Ufd1-Npl4 depletierten Zellen nachweisen. Darüber hinaus konnten wir mit quantitativen FACS Experimenten zeigen, dass p97Ufd1-Npl4 depletierte Zellen eine verminderte Aktivierung des DNA Schadenkontrollpunktes aufweisen und ein deutlicher Teil der Zellen sich trotz Bestrahlung in Mitose befindet. Ausschlaggebend für den Defekt in der Aktivierung des Kontrollpunktes ist dabei die Stabilisierung von CDC25A, da eine zusätzliche Inhibierung der CDC25 Phosphatasen den Kontrollpunkt vollständig wiederherstellt. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass p97Ufd1-Npl4 mit dem F-box Protein βTrCP der SCFβTrCP E3 Ligase interagiert. Zusammenfassend etablieren unsere Ergebnisse eine neue Funktion des p97Ufd1-Npl4 Komplexes innerhalb der DNA Schadensantwort durch die Interaktion mit der SCFβTrCP E3 Ligase und der Vermittlung des Abbaus von ubiquitinierten CDC25A. Die vorliegende Arbeit belegt dadurch eine weitere wichtige Rolle von p97 in der Erhaltung der genomischen Stabilität und Integrität.

The cell cycle is a tightly regulated process that governs faithful replication and segregation of the DNA material into two daughter cells during proliferation. In order to ensure ordered cell cycle progression, and thus maintain genomic integrity, the mammalian cell cycle harbours a number of checkpoints. The activation of cell cycle checkpoints as well as the regulation of the DNA damage response signalling pathway strongly depends not only on multiple phosphorylation events, but also on the timely degradation of cell cycle regulators by the ubiquitin-proteasome system (UPS). A central component of the UPS is the AAA+-type ATPase p97, which recognizes ubiquitylated substrates and targets them for proteasomal degradation. Together with one of its co-factors, Ufd1-Npl4, p97 acts at multiple stages during cell cycle progression, including mitosis and S phase, thus ensuring ordered progression under physiological conditions and, importantly, in response to DNA damage. Depletion of p97Ufd1-Npl4 leads to severe defects in chromosome segregation during mitosis, which might not be fully explained by its mitotic function but may as well be caused by its interphase functions. Therefore, this work aimed at elucidating the relevance of p97Ufd1-Npl4 interphase functions on the manifestation of chromosome segregation defects in mitosis. Furthermore, we investigated the molecular basis of the role of p97Ufd1-Npl4 complex in modulating the G2/M checkpoint after DNA damage induction in human somatic cells. Here, we show that p97 is required to ensure robust activation of the G2/M checkpoint after ionizing irradiation (IR), protecting cells from entering mitosis despite DNA damage and thus suppressing the manifestation of chromosomal instability. Depletion of p97Ufd1-Npl4 in cells exposed to IR, led to an increase in segregation defects, which are caused by pre-mitotic errors not being repaired before entering mitosis, indicating a defective DNA damage response. Indeed, analysing the key regulators and effectors of the DNA damage response pathway, we found a delayed CDC25A degradation in Ufd1-Npl4 depleted cells. Moreover, using a quantitative FACS approach, we showed that depletion of the p97Ufd1-Npl4 complex led to an impaired G2/M checkpoint after irradiation with a considerable fraction of mitotic cells. Importantly, we showed that p97Ufd1-Npl4 ensures proper degradation of CDC25A and that persistent activity of the stabilized CDC25A causes a negligent G2/M checkpoint activation, as this phenotype was rescued by additional inhibition of CDC25 phosphatases. Moreover, we showed that p97Ufd1-Npl4 physically interacts with the SCF E3 ligase F-box protein βTrCP, confirming the emerging evidence for the connection of p97 to multiple E3 ligase substrates. These results establish a novel function of the p97Ufd1-Npl4 complex in facilitating CDC25A degradation downstream of ubiquitination by βTrCP and highlight a crucial aspect of p97 function for maintaining genome stability and integrity.

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Riemer, Anne: The role of the AAA+ -ATPase p97 in the regulation of cell cycle checkpoint activation in response to DNA damage. 2015.

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