Proteolysis and ATP-independent disaggregation of Tau aggregates by the human serine protease HTRA1

Pöpsel, Simon

Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle gewährleisten die korrekte Faltung, Lokalisation und Mengen der zellulären Proteine und sichern dadurch die Intaktheit des Proteoms. Wenn dies nicht in ausreichendem Maß gelingt, kann es zur vermehrten Fehlfaltung von Proteinen kommen, was den Verlust ihrer normalen Funktionsweise und die Ansammlung unlöslicher Aggregate zu Folge haben kann. Enzyme der Proteinqualitätskontrolle katalysieren die Faltung von neu synthetisierten und Rückfaltung beschädigter Proteine, den proteolytischen Abbau alter, geschädigter oder fehlgefalteter Proteine, oder das Auflösen von Aggregaten mit folgender Rückfaltung oder Proteolyse. Insbesondere der letztere Prozess, die Disaggregation, stellt besondere Anforderungen an die beteiligten Enzyme, da Proteinaggregate sehr stabile Komplexe sind, deren Auflösung und Proteolyse nach bisherigem Wissensstand den Einsatz chemischer Energie aus der Hydrolyse von ATP erfordert. HtrA Proteasen sind in ATP unabhängige, hochkonservierte Serinproteasen, deren Rolle für die Proteinqualitätskontrolle in vielen Spezies nachgewiesen und detailliert untersucht werden konnte. Die humanen HtrAs erfüllen offenbar vielfältige Funktionen, da sie mit vielen grundlegenden zellulären Prozessen assoziiert sind, z.B. mit Zellmigration, Wachstum und Apoptose. Eine Assoziation von HTRA1 mit Proteinablagerungen in der Alzheimerschen Krankheit (AD), sowie die durch HTRA1 katalysierte Proteolyse des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau, das in AD Aggregate ausbildet, ließen eine Rolle von HTRA1 in der Proteinqualitätskontrolle humaner Zellen vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den biochemischen Mechanismus des Abbaus von Tau, insbesondere von amyloiden Tau Aggregaten durch HTRA1 zu charakterisieren, da die Proteolyse von Tau Aggregaten eine Möglichkeit darstellt, wie neuronale Zellen sich vor schädlichen Effekten dieser Ablagerungen schützen könnten. Es konnte hier gezeigt werden, dass neben löslichem Tau auch verschiedene Formen von Tau Aggregaten durch rekombinantes HTRA1 proteolytisch abgebaut werden konnten. Dies galt auch für solche Aggregate, die spektroskopischen und rasterkraftmikroskopischen Untersuchungen zufolge den fibrillären, mit neurodegenerativen Prozessen assoziierten Tau- Aggregaten entsprachen. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde vermutet, dass HTRA1 eine Disaggregaseaktivität aufweist, die das Auflösen von stabilen Tau Aggregaten ermöglicht und damit dazu beiträgt, dass auch aggregiertes Tau durch HTRA1 proteolysiert werden kann. Mithilfe von Ultrazentrifugation und Rasterkraftmikroskopie konnte schließlich gezeigt werden, dass eine proteolytisch inaktive HTRA1-Mutante Tau Fibrillen auflösen konnte. Diese Disaggregation ermöglichte außerdem einen erleichterten proteolytischen Abbau von Tau Aggregaten nach anschließender Zugabe von proteolytisch aktivem HTRA1. Die massenspektrometrische Analyse der proteolytischen Spaltprodukte verdeutlichte, dass durch die Disaggregation insbesondere diejenigen Bereiche des Tau Proteins vermehrt hydrolysiert wurden, die sich in dem schwer zugänglichen Kern befanden. Somit konnte ein Modell vorgeschlagen werden, demzufolge HTRA1 eine ATP unabhängige Disaggregaseaktivität besitzt, die es der Protease ermöglicht, nach Auflösung der festen Struktur des Kerns der Aggregate auch zu den Bereichen Zugriff zu bekommen, die vermutlich zu der Persistenz von amyloiden Aggregaten unter pathologischen Bedingungen beitragen. Experimente mit HTRA1 Mutanten, deren PDZ Domäne mutiert oder deletiert war, lassen eine Rolle der PDZ Domäne im Prozess der Disaggregation vermuten. Allerdings ist der genaue Mechanismus und das Ausmaß der Beteiligung der PDZ Domäne noch unklar, da auch ohne diesen Teil des Enzyms eine Disaggregation möglich war, wenn auch mit weniger deutlichem Effekt auf die anschließende Proteolyse durch aktives HTRA1. In Zellkulturexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass rekombinantes HTRA1 von kultivierten humanen Zellen aufgenommen wurde und im Zytoplasma mit seinem Substrat Tau kolokalisierte. Dies zeigt zum Einen einen möglichen Weg auf, mit Hilfe dessen das sezernierte HTRA1 Protein auch intrazellulär zur Verfügung gestellt werden könnte. Zum Anderen eröffnete dieses Phänomen die Möglichkeit, in einem experimentellen Modell der intrazellulären Tau Aggregation die Mengen an zytoplasmatischem HTRA1 zu manipulieren. Diese Vorgehensweise wurde genutzt um zu zeigen, dass HTRA1 nicht nur in vitro, sondern auch in humanen Zellen Tau Aggregate disaggregieren und proteolysieren konnte, da erhöhte Mengen an intrazellulärem, proteolytisch inaktivem, sowie auch aktivem HTRA1 zu einer Verminderung der Menge an Tau Aggregaten führten. Zusammenfassend lässt sich also festhalten, dass anhand der hier dargelegten experimentellen Daten ein Mechanismus der Proteinqualitätskontrolle für HTRA1 nachgewiesen wurde, der nicht nur das bis hierher bekannte Repertoire der HtrA Proteasen erweitert, sondern auch einen neuartigen Mechanismus der ATP-unabhängigen Disaggregation zeigt. HTRA1 vereinigt also Protease- und Disaggregasefunktionen in einem Enzym und kann folglich als ein neuer Faktor der Proteinqualitätskontrolle betrachtet werden, der ein interessantes Ziel pharmazeutischer Intervention in neurodegenerativen Erkrankungen wie beispielsweise AD darstellen könnte.

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Pöpsel, Simon: Proteolysis and ATP-independent disaggregation of Tau aggregates by the human serine protease HTRA1. 2015.

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