DuEPublico 2

Dies ist unser neues Repositorium, derzeit für E-Dissertationen und ausgewählte weitere Publikationen. Weitere Informationen...

Synthese sulfatierter Substratpeptide zur Validierung eines CCR5-Inhibitors und Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen des N-Terminus von hPar14 anhand semisynthetisch hergestellter Proteine und modifizierter Peptide

Matena, André

Das durch HIV ausgelöste erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) ist bis heute nicht heilbar, nahezu 28 Millionen Menschen starben bislang an den Folgen von AIDS. Daher ist die Entwicklung eines Impfstoffes oder eines wirksamen Medikamentes von großem Interesse. Der Infektionsmechanismus ist gut verstanden und ermöglicht viele pharmakologische Ansätze. Der Virus dringt über Chemokinrezeptoren (CCR5) in menschliche T Zellen ein, dabei spielt der V3-Loop des viruseigenen Glykoproteins gp120 eine entscheidende Rolle. Dieser bindet mit seiner Stammregion an den sulfatierten N Terminus und mit der Kopfregion an die ECL2-Schleife des CCR5-Rezeptors. Hier soll ein Entry-Inhibitor entwickelt werden, der einem natürlichen Protein entspricht. Dieser Inhibitor soll hochaffin an den sulfatierten N-Terminus des CCR5-Rezeptors binden und diesen maskieren. Um geeignete Binder finden zu können, muss der N-Terminus des CCR5 Rezeptors in sulfatierter Form vorliegen. Daher bestand die erste Aufgabe darin, diesen N-Terminus auf Basis sulfatierter Peptide herzustellen. Die einen Peptide wurden so konzipiert, dass sie nach der Synthese an einer festen Phase gebunden bleiben. Dadurch können sie als Trägermaterial für die Affinitätschromatographie eingesetzt werden und einen geeigneten Binder aus einer Substanzbibliothek fischen. Die anderen Peptide besitzen einen Fluorophor, mit denen eine Fluoreszenzanisotropie-Analyse der Bindungsaffinität in physiologischer Lösung möglich ist. Hierbei wurde die Säurelabilität der sulfatierten Peptide berücksichtigt und durch die Verwendung eines speziellen Harzes eine geeignete Synthesestrategie entwickelt. Das zweite Projekt beschäftigt sich mit hPar14 einer PPIase aus der Familie der Parvuline. Die genaue Funktion dieses Proteins ist bis heute nicht geklärt. Der N-Terminus ist hoch flexibel, positiv geladen und besitzt neben einem Kernlokalisationssignal mehrere posttranslationale Modifikationen (PTM). Eine genauere Untersuchung dieser PTM könnte Hinweise auf die Funktion des Proteins geben. Da PTM in E. coli rekombinant nicht herstellbar sind, wurde die Semisynthese etabliert. Hierzu wurden in erster Linie zwei semisynthetische Protein-Varianten (ATTO 488-PSer19-hPar14 und ATTO 488 Ala19 hPar14) hergestellt, um eine Phosphorylierung an Ser19 zu untersuchen. Dabei wurde in einer CD-Spektroskopie-Analyse eine strukturelle Veränderung mit erhöhten -Faltblattanteilen der Phosphoserin-Variante festgestellt. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der semisynthetischen Proteine konnten eine erhöhte Kernlokalisation der phosphorylierten Variante gegenüber der Kontrolle zeigen. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass sich beide semisynthetischen Proteine in subnuklearen Strukturen von U-2 OS-Zellen anlagern. Eine Kontrollgruppe transient transfizierter hPar14-EYFP-Fusionsproteine zeigte vergleichbare Ergebnisse mit einer erhöhten Kern- und subnuklearen Lokalisation. Abschließend wurde das Bindungsverhalten des hPar14-Proteins anhand vier unterschiedlich acetylierter hPar14-Peptide untersucht. Dabei wurde die N-terminale Sequenz 8GSGKAGKGGAA18 mit Acetylierungen an K11, K14, K11 und K14 versehen. Diese drei Peptide und ein zusätzliches Kontrollpeptid wurden gegenüber den vier unterschiedlichen Bromodomänen PCAF, GCN5, BRDT1 und BRD4(2) mittels Fluoreszenzanisotropie auf ihre Bindung hin charakterisiert. Hierbei ergab die Acetylierung an K11 von hPar14 eine adäquate Bindungsaffinität zu BRDT1, womit das Protein als potentieller Bindungspartner für hPar14 in Frage kommt.

The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) induced by HIV is still incurable today, nearly 28 million people have died so far from the effects of AIDS. Therefore, the development of a vaccine or of an active medicament are of great interest. The Infection mechanism is well understood and allows many pharmacological approaches. The virus enters through the chemokine receptors (CCR5) in human T cells, therefor the V3 loop of the glycoprotein gp120 plays an important role. This binds with its stem region to the sulfated N-terminus and with the head region to the ECL2 loop of the CCR5 receptor. The goal is the development of an entry inhibitor that corresponds to a natural protein.This inhibitor should bind with high affinity to the sulfated N-terminus of the CCR5 receptor and mask it. In order to find suitable binder, the N-terminus of the CCR5 receptor must be present in sulfated form. Therefore, the first task was to produce a part of this N-terminus on the basis of sulfated peptides. Some peptides were designed for remain bound after synthesis on a solid phase. This allows them to be used as support material for affinity chromatography and fish a suitable binder from a compound library. Other peptides having a fluorophore, with which a fluorescence anisotropy analysis of binding affinity in physiological solution is possible. Here, the acid lability of the sulfated peptides were taken into consideration and a suitable synthetic strategy was developed by the use of a specific resin. The second project deals with hPar14 a PPIase from the family of parvulins. The exact function of this protein is still unknown. The N-terminus is highly flexible, positively charged and has a nuclear localization signal in addition to several post-translational modifications (PTM). A precise examination of these PTM could give clues to the function of the protein. Since PTM cannot be produced in E. coli recombinantly, semi-synthesis has been established. For this purpose, two semisynthetic protein variants (ATTO 488-PSer19-hPar14 and ATTO 488 Ala19 hPar14) were prepared to investigate phosphorylation at Ser19 in the first step. A structural change with increased -sheet proportions of the phosphoserine variant was discovered with CD spectroscopic analysis. Fluorescence microscopy of the semisynthetic proteins were able to show an increased nuclear localization of the phosphorylated variant compared with its control. It has also been shown that both semisynthetic proteins accumulate in subnuclear structures of U-2 OS cells. A control group transiently transfected hPar14-EYFP fusion proteins showed similar results with increased nuclear and subnuclear localization. Finally, the binding behavior of the hPar14 protein was studied using four different acetylated hPar14 peptides. The N-terminal sequence 8GSGKAGKGGAA18 was provided with acetylation of K11, K14, K11 and K14. These three peptides, and an additional control peptide were characterized by fluorescence anisotropy to their binding with the four different bromodomains PCAF, GCN5, BRDT1 and BRD4 (2). The adequate binding affinity of the K11 acetylated peptide to BRDT1, makes the protein come a potential binding partner for hPar14.

Vorschau

Teilen und Zitieren

Zitierform:

Matena, André: Synthese sulfatierter Substratpeptide zur Validierung eines CCR5-Inhibitors und Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen des N-Terminus von hPar14 anhand semisynthetisch hergestellter Proteine und modifizierter Peptide. 2014.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export