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Untersuchungen zur Expression ausgewählter Biomarker der periprothetischen Osteolyse an makrophagenähnlichen Zellen bei Behandlung mit dem Neuropeptid CGRP

Jablonski, Heidrun

Die periprothetische Osteolyse ist die häufigste Ursache für das Langzeitversagen von endoprothetischen Implantaten. Hierbei werden Abriebpartikel des Prothesenmaterials von Makrophagen phagozytiert. Dies löst eine inflammatorische Reaktion aus, welche über die zytokingesteuerte Rekrutierung von Osteoklasten zu periimplantärer Knochenresorption führt. Ein osteoprotektiver Einfluss des Neuropeptids Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) auf die periprothetische Osteolyse ist bekannt. In dieser Arbeit wurde der Effekt von CGRP auf den katabolen Einfluss von ultrahochmolekularen Polyethylen (UHMWPE) Partikeln und Lipopolysacchariden (LPS) in humanen Zellen untersucht. Monozytäre Zellen der Linie THP-1 wurden durch Stimulation mit Phorbol-12-myristat-13-acetat zu makrophagenähnlichen Zellen differenziert. Diese wurden zur Simulation osteolytischer Bedingungen über unterschiedliche Zeiträume (6/24/48 h) mit UHMWPE-Partikeln (Zell-Partikel-Verhältnisse 1:100 und 1:500) bzw. mit LPS (1 µg/ml) inkubiert. Zeitgleich wurde das Neuropeptid CGRP (10-8 M) appliziert. Die mRNA-Expression von Rezeptoraktivator des nukleären Faktors κB (RANK) und Tumornekrosefaktor (TNF)-α wurde mittels quantitativer RT-PCR gemessen. Der Proteinnachweis von RANK erfolgte im Western Blot. Die Sekretion von TNF-α sowie der Interleukine (IL)-1β, IL-6 und IL-10 wurde im Zellkulturüberstand mit Hilfe eines humanen TNF-α ELISA bzw. eines humanen Bio-Plex Zytokin-Assays quantifiziert. Die Expression von RANK in makrophagenähnlichen Zellen war sehr gering und nahm bei osteolytischer Stimulation nicht zu. Stimulation der Zellen mit Partikeln bzw. LPS führte in Abhängigkeit von der Stärke des osteolytischen Stimulus und der Inkubationszeit zu einem Anstieg von TNF-α mRNA und Protein sowie von IL-1β und IL-6 (p ≤ 0,049). CGRP inhibierte in zeitabhängiger Weise die mRNA-Expression von TNF-α bei geringer Partikeldosis und LPS-Stimulation (p ≤ 0,020), die TNF-α Sekretion hingegen bei Partikel- (1:100 und 1:500) und LPS-Stimulation (p ≤ 0,043). Der ausgeprägte inhibitorische Effekt von CGRP auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion bei 24 h Inkubation konnte auch bei IL-1β und IL-6 beobachtet werden (p ≤ 0,002). CGRP zeigt einen temporären inhibitorischen Effekt auf die osteolyseassoziierte Sekretion von TNF-α, IL-1β und IL-6. Dies unterstreicht die bisherigen Erkenntnisse eines potentiell osteoprotektiven Einfluss dieses Neuropeptids in der aseptischen Prothesenlockerung, welcher die Standzeit von Endoprothesen erheblich verlängern könnte.

Periprosthetic osteolysis constitutes the main reason for untimely implant failure after total joint arthroplasty. In that process particulate wear debris derived from the implant is phagocytised by macrophages. This in turn leads to an inflammatory response in which the production of various pro-inflammatory cytokines induces osteoclast-mediated bone resorption. An osteoprotective influence of the neuropeptide calcitonin gene-related peptide (CGRP) has been described. In the present study, the effect of CGRP on the catabolic impact of both ultra-high molecular weight polyethylene (UHMWPE) particles and bacterial lipopolysaccharides (LPS) was analysed in-vitro. Monocytic cells of the THP-1 cell line were differentiated into macrophage-like cells using phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA). Afterwards, the cells were stimulated with either UHMWPE particles (cell-to-particle ratios of 1:100 and 1:500) or LPS (1 µg/ml) for distinct periods of time (6/24/48 h) in order to generate virtually osteolytic conditions. Simultaneously, the cells were treated with the neuropeptide CGRP (10-8 M). The mRNA expression of both receptor activator of nuclear factor κB (RANK) and tumour necrosis factor (TNF)-α was determined by quantitative RT-PCR. RANK protein was detected employing western blot analysis. Secreted protein levels of TNF-α as well as of the interleukins (IL)-1β, IL-6 and IL-10 were quantified in cell culture supernatants using a human TNF-α ELISA or a human Bio-Plex Cytokine Assay, respectively. Levels of RANK mRNA and protein in macrophage-like cells were very low and did not increase following virtually osteolytic activation. Instead, stimulation of the cells with either particles or LPS led to a time- and stimulus-dependent increase in TNF-α mRNA and protein levels as well as to an enhanced secretion of IL-1β and IL-6 (p ≤ 0.049). CGRP time-dependently inhibited TNF-α mRNA expression as elicited by low particle numbers or LPS (p ≤ 0.020) while it suppressed both particle- (1:100 and 1:500) and LPS-induced TNF-α secretion (p ≤ 0.043). A pronounced inhibitory effect of CGRP on LPS-induced cytokine production at 24 h of incubation could also be observed with IL-1β and IL-6 (p ≤ 0.002). CGRP temporarily impairs the osteolysis-associated production of the pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, and IL-6 in-vitro. This result is consistent with the previously reported osteoprotective properties of the neuropeptide. Thus, CGRP as a therapeutic agent might potentially enhance the life-time of implants following total joint arthroplasty.

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Jablonski, Heidrun: Untersuchungen zur Expression ausgewählter Biomarker der periprothetischen Osteolyse an makrophagenähnlichen Zellen bei Behandlung mit dem Neuropeptid CGRP. 2014.

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