@PhdThesis{duepublico_mods_00034825,
  author = 	{Radtke, Stefan},
  title = 	{Entwicklung eines in vitro Nachweisverfahrens zur Analyse des Entwicklungspotentials humaner h{\"a}matopoetischer Stamm- und Vorl{\"a}uferzellen},
  year = 	{2014},
  month = 	{May},
  day = 	{28},
  keywords = 	{H{\"a}matopoetische Stammzellen; Kokultur; MSZ; HSZ; Endothel},
  abstract = 	{H{\"a}matopoetische Stammzellen (HSZ) stellen das derzeit bestuntersuchte Stammzellsystem im Menschen dar. Dennoch sind die hierarchische Organisation der Stamm- und Vorl{\"a}uferzellen sowie die genauen Linienverwandtschaft reifer Blutzellen noch immer nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt. Nach dem klassischen Modell der H{\"a}matopoese bringen HSZ multipotente Progenitoren hervor (MPP), die im weiteren Verlauf der Differenzierung entweder lymphatisch oder myeloisch spezifiziert werden. Durch die Beschreibung von Vorl{\"a}uferzellen, die lymphatisches sowie partielles myeloisches aber kein erythrozyt{\"a}res und megakaryozyt{\"a}res Differenzierungspotential aufweisen, wurde das klassische Modell mit der Aufspaltung in den lymphatischen und myeloischen Zweig von mehreren Arbeitsgruppen falsifiziert.

Das Ziel dieser Arbeit war folglich die Entwicklung einer in vitro Analysemethode, die eine Beschreibung der genauen Abstammungsverh{\"a}ltnisse in der humanen H{\"a}matopoese sowie die Detektion primitiver h{\"a}matopoetischer Stamm- und Vorl{\"a}uferzellen (HSVZ) auf Einzelzellebene erm{\"o}glicht. Als Grundlage hierzu wurde der klassische ML-IC (myeloid-lymphoid initiating cell) Ansatz verwendet, der eine retrospektive Analyse von Zellen mit lympho-myeloischem Differenzierungspotential erm{\"o}glicht. Zu untersuchende Einzelzellen werden hierzu in Kokultur mit murinen Stromazellen expandiert und das myeloische (LTC-IC) und lymphatische (NK-IC) Differenzierungspotential der Nachkommenschaft analysiert. Eine wesentliche Voraussetzung f{\"u}r den erweiterten ML-IC Ansatz stellen somit Kulturbedingungen dar, die eine Expansion von Einzelzellen ohne den Verlust des initialen Differenzierungspotentials in der neu entstehenden Nachkommenschaft erm{\"o}glichen. Weiterhin werden f{\"u}r die Analyse des Differenzierungspotentials der Nachkommenschaft funktionelle in vitro Differenzierungsans{\"a}tze f{\"u}r den Nachweis aller h{\"a}matopoetischen Linien ben{\"o}tigt.

Zu Beginn der Arbeit wurde das Entwicklungspotential expandierter HSVZ in der Suspensionskultur genauer analysiert. Primitive HSVZ mit LTC-IC, NK-IC, SRC sowie myeloischem Koloniebildungspotential konnten in der CD133+CD34+ Fraktion erhalten werden, wohingegen CD133+CD34+ HSVZ mit erythrozyt{\"a}rem innerhalb von 6 Tagen vollst{\"a}ndig verloren gingen. Zellen mit erythrozyt{\"a}rem Differenzierungspotential wurden exklusiv in der neu entstehenden CD133lowCD34+ Fraktion detektiert. Diese Beobachtung gemeinsam mit weiteren Ergebnissen aus der Arbeitsgruppe f{\"u}hrte zur Beschreibung neuer Linienverwandtschaften und eine alternativen Modellvorstellung der humanen H{\"a}matopoese. Demnach findet eine fr{\"u}he Aufspaltung in den lympho-myeloischen (CD133+CD34+) und erythro-myeloischen (CD133lowCD34+) Zweig statt, wobei Eosinophile und Basophile von CD133low erythro-myeloischen Progenitoren (EMP) und Neutrophile von CD133+ lymphatisch-spezifizierten multipotenten Progenitoren (LMPP) gebildet werden.

Da insbesondere das erythrozyt{\"a}re Differenzierungspotential in der Suspensionskultur verloren ging, wurden der Erhalt multipotenter HSVZ in Kokultur mit Zellen muriner Stromazelllinien sowie prim{\"a}ren humanen mesenchymalen und endothelialen Stromazellen analysiert, die laut der Literatur eine Expansion multipotenter HSVZ erm{\"o}glichen. {\"U}berraschenderweise erm{\"o}glichten weder die murinen noch die humanen Stromazellen einen reproduzierbaren und zuverl{\"a}ssigen Erhalt multipotenter CD133+CD34+ HSVZ. In allen getesteten Bedingungen ging das erythrozyt{\"a}re Differenzierungspotential in der CD133+CD34+ Fraktion {\"u}ber die Zeit nahezu vollst{\"a}ndig verloren. Ein Erhalt aller initialen Differenzierungspotentiale in der gesamten Nachkommenschaft wurde hingegen von einzelnen mesenchymalen sowie endothelialen Stromazellen unterst{\"u}tzt.

Derzeitige in vitro Kulturbedingungen erm{\"o}glichen keine unlimitierte Expansion prim{\"a}rer humaner Stromazellen. Um humane Prim{\"a}rzellen, die einen Erhalt aller initialen Differenzierungspotentiale erm{\"o}glichen, f{\"u}r die weiterf{\"u}hrende Analysen sowie die initiale Expansionsphase im erweiterten ML-IC Ansatz zu konservieren, wurden ein System zur konditionellen Immortalisierung selektionierter Stromazellen etabliert. Von den immortalisierten humanen Prim{\"a}rzellen unterst{\"u}tzten insbesondere Zellen der mesenchymalen Stromazelllinie KM MNZ B Klon 2 einen reproduzierbaren Erhalt von HSVZ mit T-Zell, NK-Zell, Makrophagen/Monozyten, Granulozyten (Neutrophile, Basophile, Eosinophile), Megakaryozyten sowie Erythrozyten Potential. Diese Stromazellen erm{\"o}glichen folglich geeignete Kulturbedingungen f{\"u}r die initiale Expansionsphase im erweiterten ML-IC Ansatz.

Auch wenn der erweiterte ML-IC Ansatz bislang nicht vollst{\"a}ndig etabliert ist, konnte diese Arbeit wesentliche Ergebnisse zur Beschreibung neuer Linienverwandtschaften sowie einer alternativen Modellvorstellung der humanen H{\"a}matopoese beitragen. Der Befund, dass multipotente HSVZ die einzigen CD133+CD34+ Zellen mit erythrozyt{\"a}rem Differenzierungspotential darstellen, erm{\"o}glicht zudem eine einfache Detektion und Quantifizierung multipotenter HSZ/MPP in weiterf{\"u}hrenden Versuchen.
Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit zus{\"a}tzliche linienspezifische in vitro Differenzierungsans{\"a}tze zur Detektion von Zellen mit CFC, T-Zell, Erythrozyten sowie Megakaryozyten Potential erfolgreich etabliert. Gemeinsam mit der Qualifizierung einer humanen mesenchymalen Stromazelllinie, die den Erhalt aller getesteten Linienpotentiale in der h{\"a}matopoetischen Nachkommenschaft erm{\"o}glicht, stellen diese Vorarbeiten eine wichtige Grundlage f{\"u}r die zuk{\"u}nftige Analyse einzelner HSVZ im erweiterten ML-IC Ansatz dar.},
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