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Efficient support of DNA replication functions by DNA ligase 3 in vertebrate cells

Bednar, Theresa

The results show a remarkable and hitherto unexpected functional flexibility in DNA replication of LIG1 and LIG3 in vertebrates. While the lethality of the LIG3 knockout is solely due to the mitochondrial function and not due to an essential function in the nucleus, it was conclusively shown that LIG3 can backup replication in the absence of LIG1 and that LIG4 is not capable to do so. The results in this thesis conclusively show that the ZnFn domain of LIG3 is essential for the DNA replication function of LIG3, although it is not essential for maintaining mitochondrial integrity. Furthermore, the BRCT domain with which LIG3 interacts with XRCC1 is also essential for the replication function of LIG3. In colocalization experiments it could be shown that LIG3 is recruited to DNA replication sites when LIG1 activity is impaired, and that the recruitment of PCNA is weakened. The results, therefore, point to a different recruitment system of LIG3 to replication factories compared to the one required for LIG1 recruitment. Furthermore the mutants used were characterized with regard to their ability to activate checkpoint responses after induction of DNA damage. Apoptosis complicates analysis of the S-phase checkpoint which requires high doses of radiation for reliable quantification. On the other hand, DT40 cells display a normal G2 checkpoint that remains unaffected by ligase deletion.

Die Ergebnisse in dieser Arbeit zeigen eine bemerkenswerte und bisher unerwartete Flexibilität in der DNA Replikation zwischen DNA Ligase 1 (LIG1) und DNA Ligase 3 (LIG3) in Vertebraten. Während die Letalität des LIG3 Knock-outs ausschließlich in der mitochondrialen Funktion und nicht in einer essentiellen Funktion im Zellnukleus begründet liegt, wird eindeutig gezeigt, dass LIG3 die Funktion von LIG1 in der Replikation voll übernehmen kann und dass DNA Ligase 4 (LIG4) nicht dazu in der Lage ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eindeutig, dass die Zink-Finger-Domäne von LIG3 essentiell für die Funktion von LIG3 in der Replikation ist, obwohl sie nicht essentiell für das Aufrechterhalten der Integrität der Mitochondrien ist. Außerdem wird gezeigt, dass die BRCT Domäne, mit deren Hilfe LIG3 mit XRCC1 interagiert, ebenfalls essentiell für die Rolle von LIG3 in der Replikation ist. In Co-Lokalisations-Experimenten konnte gezeigt werden, dass LIG3 zu Replikationszentren rekrutiert wird, wenn die Aktivität von LIG1 beeinträchtigt ist und dass die Rekrutierung von PCNA in diesem Hintergrund schwächer ist. Die Ergebnisse weisen auf einen unterschiedlichen Rekrutierungsmechanismus von LIG3 zu Replikationszentren hin im Vergleich zu dem für die Rekrutierung von LIG1 benötigten. Auch konnten die Mutanten, die in dieser Arbeit verwendet wurden, weitergehend charakterisiert werden in Bezug auf ihre Fähigkeit, Zellzyklus Kontrollpunkte nach Induktion von DNA Schäden zu aktivieren. Apoptose verkompliziert die Analyse des S-Phase Kontrollpunkts, da für eine verlässliche Quantifizierung hohe Dosen Strahlung benötigen werden. Andererseits zeigen DT40 Zellen einen normalen G2 Kontrollpunkt, der unbeeinträchtigt von Ligase Knock-outs bleibt.

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Citation style:

Bednar, Theresa: Efficient support of DNA replication functions by DNA ligase 3 in vertebrate cells. 2013.

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