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Reversible self-assembled monolayers as biosensor platforms

Tenboll, Annabell

The development of ultra-sensitive sensors is a prerequisite for better diagnostic tools. One approach that addresses this issue is the development of reversible self-assembled monolayers. In this work the synthesis and stepwise assembly of self-assembled monolayers is presented. In contrast to the well established covalently bound alkanethiols on gold, reversible SAMs (rSAMs) are attached via non-covalent interactions. This property provides some important advantages. Firstly, functionalized samples can be reused by easily washing away the bound molecules, e.g. by a pH change. Secondly, their dynamic nature renders the SAM adaptable for an optimal packing of the adsorbed probes and enhanced sensing. Previously, it had been demonstrated that α,ω-bis(4-amidinophenoxy)alkanes form reversible layers of carboxylic acid functionalized thiol SAMs on gold. The interaction between the negatively charged carboxylic acid function and the positively charged amidinium are based on the protonation status of the acid. Alkaline pH media lead to cyclic, directed, stable hydrogen bonds. Hence, in case of a lowered pH the amphiphile layer can be removed from the carboxylated surface. By introducing a biological function to the α,ω-bis(4-amidinophenoxy)alkanes a novel biosensor platform should be developed. The first sensor platform used biotin to anchor streptavidin. Streptavidin can in turn act as an anchor for biotinylated antibodies. Two different antigens specific for the used antibody were detected and implemented to proof the selectivity and sensitivity of the sensor. The detected analytes were human serum albumin - as a proof of concept - and prostate specific antigen (PSA) for detection of a real sample. PSA was detected from human serum samples in a pM range. By diluting the biotinylated amphiphiles with hydroxylated spacer molecule the head group sensor sensitivity increased, reflecting a better match with the streptavidin topology. The second biological function introduced was sialic acid (SA). SA can specifically bind hemagglutinin (HA), which is involved in the infection by influenza viruses. This second sensor consisted of the sialic acid terminated amphiphile, which was reversibly attached on the carboxylated gold substrate. In a first series of experiments, the hemagglutinin protein was detected. Then the detection of influenza virus like particle (VLP) was performed. The different molar ratios of spacer molecule to functional molecule were explored for optimal binding conditions. Reusability of the sensor was tested by switching the pH and rinsing off the reversible attached molecules under acidic pH conditions. The kinetics for the assembly and disassembly processes were followed by in-situ ellipsometry. With this method the film growth on the substrate could be displayed. Other methods for characterization were infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS), contact angle measurements and atomic force microscopy (AFM).

Die Entwicklung von ultrasensitiven Sensoren ist eine Voraussetzung für eine bessere Diagnostik in der Medizin. Ein Ansatz, dieses Problem anzugehen, ist die Entwicklung von reversiblen, selbstorganisierten Monoschichten. In dieser Doktorarbeit wird die Synthese und der schrittweise Aufbau dieser Schichten entwickelt. Im Gegensatz zu den etablierten, kovalent gebunden Alkanthiolen auf Gold, sind reversible SAMs (rSAMs) über nicht-kovalente Wechselwirkungen gebunden. Diese Eigenschaft bietet ihnen einige wichtige Vorteile. Erstens können die gebundenen Moleküle durch einfaches Waschen entfernt und wiederverwendet werden, und zweitens macht ihre dynamische Natur die SAMs anpassungsfähig, so dass eine optimale Packung der adsorbierten Sonden vorliegt und verbesserte Sensoreigenschaften generiert werden. In früheren Arbeiten dieser Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass α, ω-bis (4-Amidinophenoxy)alkane reversible Schichten auf carbonsäurefunktionalisierten Thiol SAMs auf Gold bilden. Diese Wechselwirkungen entstehen zwischen der negativ geladenen Karbonsäurefunktion und dem positiv geladenen Amidin, aufgrund des Protonisierungsgrades der Säure. Es entstehen in alkalischen pH-Medien zyklische, gerichtete, stabile Wasserstoffbrücken. Aufgrund diesen pH-abhängigen Verhaltes kann nach Absenken des pH-Werts die Amphiphilschicht von der karboxylierten Oberfläche entfernt werden. Durch die Einführung einer biologischen Funktion an die α,ω-bis (4-Amidinophenoxy) alkane sollte eine neuartige Biosensor-Plattform entwickelt werden. Die erste Sensor-Plattform nutzte Biotin, um Streptavidin zu verankern. Streptavidin kann wiederum als Anker für biotinylierte Antikörper wirken. Es konnten zwei verschiedene Antigene spezifisch für die verwendeten Antikörper mit dem Sensor mit hoher Empfindlichkeit detektiert werden. Die detektierten Analyten waren humanes Serumalbumin - als „proof of concept“ - und Prostata-spezifisches Antigen (PSA) zur Detektion in biologischen Proben. PSA konnte in pM Konzentration in einer menschlichen Serumprobe nachgewiesen werden. Durch Verdünnen der biotinylierten Amphiphile mit hydroxylierten Spacermolekülen wurde die Kopfgruppen-Sensor-Empfindlichkeit erhöht, was einer besseren Übereinstimmung mit der Streptavidin-Topologie entspricht. Die zweite biologische Funktion die eingeführt wurde, war Sialinsäure (SA). SA kann Hämagglutinin (HA) spezifisch binden. HA ist an der Infektion durch Influenzaviren beteiligt. Dieser zweite Sensor besteht aus dem Sialinsäure-terminierten Amphiphil, das reversibel an das carboxylierte Goldsubstrat angebracht wird. In einer ersten Reihe von Experimenten wurde reines Hämagglutinin-Protein detektiert, bevor die Detektion der influenzavirusartigen Partikeln (VLP) durchgeführt wurde. Die verschiedenen Molverhältnisse von Spacermolekül zu funktionellem Molekül wurden für die optimalen Bindungsbedingungen untersucht. Die Wiederverwendbarkeit des Sensors wurde getestet, indem das Substrat mit pH 3-Puffer gespült und somit die reversibel angelagerten Moleküle abgelöst wurden. Die zeitabhängige Anlagerung und Regenerierung wurde mittels in-situ Ellipsometrie aufgezeichnet. Mit dieser Methode konnte das Filmwachstum auf dem Substrat nachgewiesen werden. Andere Methoden zur Charakterisierung waren Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie (IRRAS), Kontaktwinkelmessungen und Rasterkraftmikroskopie (AFM).

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Tenboll, Annabell: Reversible self-assembled monolayers as biosensor platforms. 2013.

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