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Charakterisierung der proteomischen, metabolomischen und funktionellen Reaktionen in endothelialen Zellen nach Langzeitexposition gegen Dieselrußsurrogate

Pink, Mario

Zielsetzung der Arbeit war, molekulare bzw. zelluläre Effekte an endothelialen Zellen nach Langzeitexposition gegen die Dieselrußsurrogate Carbon Black und Benzo[a]pyren-beladenes Carbon Black im Niedrigdosisbereich zu ermitteln. Dieselruß ist in Abhängigkeit vom Entstehungsort mit einer Vielzahl von Substanzen wie Übergangsmetallen (z. B. Eisen, Chrom), Salzen und organischen Verbindungen (z. B. PAH) belastet, die selbst zelluläre Effekte auslösen können. Daher sollten in dieser Arbeit die Zellen gegen die Diesel¬ruß-surrogate Carbon Black und B[a]P-beladenes Carbon Black exponiert werden. Benzo[a]pyren (Leitsubstanz der PAH) sollte stellvertretend für die Gruppe der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe die Kontamination von Dieselruß mit dieser Stoffgruppe simulieren. Diskutierte Mechanismen zur Entwicklung von Feinstaub-vermittelten kardiovaskulären Erkrankungen beruhen auf Experimenten, bei denen meist Ultrafeinstaub¬partikel in hohen Dosen über einen kurzen Zeitraum eingesetzt wurden. Die Exposition des Menschen erfolgt im Gegensatz zu den gängigen experimentellen Studien über einen längeren Zeitraum gegen geringe Dosen. Aus diesem Grunde wurden in der vorliegenden Arbeit ein Expositionszeitraum von 14 Tagen sowie eine Exposition im Niedrigdosisbereich gewählt. Die Exposition der Endothelzellen gegen eine niedrigere bzw. physiologischere Konzentration von Dieselru߬surrogaten steigerte die Proliferation und veränderte den Energiehaushalt, jedoch nicht die Generierung von ROS. Diese Antworten ließen sich anhand der Ergebnisse der proteomischen Analyse exponierter Zellen zu einem großen Teil auf eine verringerte Aktivität des Transkriptions¬faktors PPARγ zurückführen. Die Hypothese, dass PPARγ ein wichtiger Regulator der beobachteten zellulären Reaktionen ist, wurde durch die gas¬chromato¬graphische Analyse der zellulären Metaboliten erhärtet. So wurden die in der Literatur beschriebenen Veränderungen im Energiestoffwechsel infolge einer verminderten PPARγ-Aktivität in der vorliegenden Arbeit anhand des Nachweises einer erhöhten intrazellulären Konzentration an freien Fettsäuren und eines durch die gesteigerte Proliferation erhöhten Energiebedarfs bestätigt. Da zu erwarten war, dass die bereits identifizierten Proteine nicht die Gesamtheit der beeinflussten Signalwege repräsentieren, wurde zusätzlich das Phosphoproteom untersucht. Die Analyse phosphorylierter Proteine ist jedoch eine schwierige Aufgabe in Anbetracht ihres geringen Vorkommens. Die Anreicherung der Phosphoproteine schien dabei als ein vielversprechender Ansatz, verfügbare Techniken setzten jedoch hoch¬technisierte Geräte voraus. Daher wurde ein Verfahren zur einfachen Anreicherung mittels Lanthanionen (La3+) entwickelt, durch dessen Anwendung Phosphoproteine und Phospho¬glykoproteine selektiv aus komplexen Proteingemischen isoliert werden konnten. Die Analyse des Phosphoproteoms endothelialer Zellen nach Exposition ergab Änderungen der Phosphorylierung von Proteinen, die neben katalytischen Prozessen auch die Struktur der Zellen beeinflussten. Die Modifikationen der zytoskelettalen Proteine wiesen auf ein erhöhtes Angio¬genese¬potential hin, was sich in funktionellen Tests (Migration, Invasion, Barriere-funktion) bestätigte. Der Anteil migrierender Zellen sowie ihre Invasionsbereitschaft erhöhten sich nach Exposition gegen die Dieselrußsurrogate. Darüber hinaus wiesen die exponierten Zellen eine verringerte Permeabilität gegenüber geladenen und ungeladenen Substanzen (Dextrane) auf. Die funktionellen Veränderungen spiegelten sich auch auf morphologischer Ebene in der Ausbildung von Filopodien und Stressfasern wider. Als möglicher Auslöser dieser zellulären Veränderungen kommt der erhöhte Gehalt an intrazellulärem Calcium infrage. Calcium stellt einen wichtigen zellulären Signaltransduktor dar, der an vielen Prozessen, darunter der Regulation der endothelialen Stickstoffmonoxid-Produktion, beteiligt ist. Die endotheliale NO-Produktion ist ein wichtiger Modulator der Angiogenese, die viele der beobachteten Effekte beeinflussen kann. Die hier vorgestellten Ergebnisse beschreiben detaillierte Veränderungen des Endothels als Antwort auf eine Exposition gegen Dieselrußsurrogate. Ob und ggf. welche/s Krankheits-bild/er diese Veränderungen hervorrufen können, ist zum jetzigen Zeitpunkt noch unklar.

Nanotechnology is a rapidly growing industry of global economic importance, exploiting the novel characteristics of materials manufactured at the nanoscale. The properties of engineered nanoparticles (ENPs) that make them useful in a wide range of industrial applications, however, have led to concerns regarding their potential impact on human and environmental health. Nanometer sized particles are created in countless physical processes ranging from natural calamities such as erosion and combustion to many industrial and domestic endeavours, such as cooking, material fabrication, jet engines and in intentionally engineered nanoscale components of consumer products and advanced technologies. The impact of nanoparticles interactions with the body is dependent on their size, chemical composition, surface structure, solubility and shape. Due to small size and hence higher specific surface area of the nanoparticles, these particles can easily bind with toxic pollutants such as transition metals and organic pollutants (i.e. polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH)), which when inhaled can cause a number of diseases. Inhaled nanoparticles have the ability to translocate in the body. Once inside, these particles can travel freely in the blood throughout the body and reach the organs like liver, heart and brain. Epidemiologic studies have indicated that environmental exposure to airborne particulate matter (primarily diesel exhaust) may promote cardiovascular diseases; however, it is not clear whether these effects are due to the exposure to these environment particles or because of its co-contaminants (i.e. iron, chromium, salts and PAHs). The precise ways of action are still unknown and the suggested mechanisms often lack the convincing evidence because they have been derived from experiments in which nanoparticles have been applied in high doses. In the present study the human endothelial cell line EA.hy926 was exposed to pure carbon black and benzo[a]pyrene loaded carbon black to mimic diesel exhaust, to determine the effects of these nanoparticles on the cardiovascular system. To achieve this, a proteomic and metabolomic approach was carried out with particular emphasis on an extended exposure period of 14 days and a low nanoparticle concentration of 100 ng/mL. Evaluation of the obtained proteomic data combined with transcription factor analysis revealed that the activity of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) was significantly reduced in the exposed cells. This result was in agreement with the observed profile of energy and fatty acid metabolites determined by gas chromatographic mass spectrometric analysis. Given that the previously identified proteins did not represent the entirety of the affected signaling pathways, therefore, possible posttranslational modifications of the exposed endothelial cells was examined. Phosphorylation is one of the most universal and dominant mechanism involved in the regulation of cellular metabolism. Due to the low abundance of phosphorylated proteins there is a great interest in developing methods for their enrichment. Using lanthanum ions, a simple technique for phosphoprotein enrichment was established. The method not only allowed the selective enrichment of phospho- and phosphoglycoproteins from complex protein mixtures, but also was compatible with analytical techniques. The analysis of the phosphoproteome of endothelial cells after exposure revealed changes in the phosphorylation of proteins involved in cell structure maintenance. These changes in the phosphorylation referred thereby to modulations in the angiogenic system which could be shown by an increased cell invasion and migration, and structural changes of the actin cytoskeleton. The trigger of these cellular responses is possible calcium which was present in elevated levels in exposed cell and may influence the endothelial NO production.

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Pink, Mario: Charakterisierung der proteomischen, metabolomischen und funktionellen Reaktionen in endothelialen Zellen nach Langzeitexposition gegen Dieselrußsurrogate. 2013.

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