Neue molekulare Pinzetten und die Hemmung der Enzyme PARP-1/G6PD
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden Untersuchungen zu der Hemmung des Enzyms Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP-1) durch die Phosphatpinzette mit dem Einsatz eines Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) erweitert. Zu den bereits durchgeführten Messungen zu der mittleren inhibitorischen Konzentration erfolgten weitere Kinetikmessungen mit verschiedenen Konzentrationen an Phosphatpinzette. Weitere Untersuchungen umfassten die Hemmung der Glucose-6-phosphat Dehydrogenase (G6PD) durch die Phosphatpinzette. Neben der Bestimmung der mittleren inhibitorischen Konzentration und der Enzymkinetik wurde die Hemmung auf eine mögliche Denaturierung des Enzyms und die vorliegende Stöchiometrie des Komplexes untersucht. Ferner wurde in der vorliegende Doktorarbeit neue molekulare Pinzetten entwickelt, die einen strukturellen Unterschied zu der Phosphatpinzette aufweisen. Es wurde durch die Überführung in ein anderes Anion die Wirkung des Phosphats auf die Bindungsaffinität untersucht. Die Entwicklung einer unsymmetrischen Pinzette mit zwei verschiedenen Anionen hat weiteren Aufschluss über die Effektivität der Phosphatgruppe geliefert. Untersuchungen an unsymmetrischen Pinzetten sollten zudem eine Übersicht liefern, in wie weit eine Erkennungseinheit zur Spezifizierung der Hemmung an diese angebracht werden kann. Die Untersuchungen wurden gestützt durch Fluoreszenz- und 1H-NMR-Spektroskopie, ITC, sowie durch Moleküldynamische Simulationen.
This thesis extends the knowledge about the inhibition mechanism of the enzyme Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP-1) by phosphate tweezers. The application of an Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) validates the proposed results. Enzyme kinetic studies extend the results of the inhibition mechanisms. Additionally this thesis is dealing with the inhibition of the enzyme Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) by phosphate tweezers. In addition to the IC50-values and the enzyme kinetics the inhibition is determined by a possible denaturation. The stoichiometry of the enzyme-tweezers complex is also given. Another part of the thesis is the synthesis of new molecular tweezers. These new molecular tweezers are tweezers with another anion pair. This anion pair should give knowledge about the good binding affinity of the phosphate tweezers. A new tweezer with one phosphate and another anion substituent enhanced the information about effects of the phosphate substituents. Studies with other unsymmetrical tweezers should give an overview about the recognition units to specify inhibition by the tweezers. The studies were performed by fluorescence, 1H-NMR spectroscopy, ITC and molecular modeling.
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