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Etablierung und Charakterisierung von biodegradierbaren Calciumphosphat Nanopartikeln zur Induktion potenter anti-viraler T-Zellantworten

Knuschke, Torben

Die immunologischen Abwehrmechanismen gegen Infektionskrankheiten sind sehr komplex. Dabei sind die verschiedenen Bereiche des Immunsystems gegen die Infektion einzelner Pathogene unterschiedlich effektiv. Während neutralisierende Antikörper schützend gegen einige Virusinfektionen wirken, sind sie gegen andere, wie z.B. HIV Infektionen, nicht ausreichend. Dies ist unter anderem in der Morphologie und Pathologie des jeweiligen Virus begründet. Die Möglichkeit Pathogen-spezifische T-Zellantworten zu induzieren ist in solchen Fällen für neuartige Vakzine von besonderer Wichtigkeit. Nanopartikuläre Ansätze werden dabei als sehr effektive Immunisierungsvehikel angesehen. Die partikuläre Struktur der Nanopartikel, sowie die Funktionalisierung mit immunogenen Strukturen von Bakterien oder Viren, ergeben ein Pathogen-Mimikry, welches eine Pathogen-ähnliche Aktivierung des angeborenen Immunsystems und damit Initiierung einer Immunantwort erlaubt. In dieser Arbeit wurde der Einsatz von biologisch abbaubaren Calciumphosphat (CaP) Nanopartikeln als Immunisierungsvehikel untersucht. CaP Nanopartikel wurden mit Toll-like Rezeptor (TLR)-Liganden CpG (TLR9) oder poly(I:C) (TLR3), sowie viralen Antigenen funktionalisiert und die schnelle Aufnahme dieser Nanopartikel durch Dendritische Zellen (DCs) gezeigt. Die Aufnahme der Nanopartikel in vitro führte zur Reifung der DCs und zur Induktion einer Virus-spezifischen T-Zell-Antwort. Immunisierungsexperimente mit funktionalisierten CaP Nanopartikeln gegen das Influenza Virus und das retrovirale Friend Virus zeigen deutlich, dass es zur Induktion Virus-spezifischer IFN-γ-produzierender CD4+ und CD8+ Effektor T-Zellen kommt. Die anti-virale Funktion dieser Zellen wurde in anschließenden Infektionsexperimenten gezeigt. Sowohl die Influenza-Viruslast als auch die Friend-Viruslast konnte signifikant reduziert werden. Die erzielten Ergebnisse zeigen das Potential des neu entwickelten Nanopartikel-Systems für den Einsatz in der prophylaktischen Vakzinierung sehr deutlich. Einige virale Infektionen resultieren jedoch nicht in der vollständigen Klärung der Pathogene und können zu chronisch persistierenden Infektionen führen. Immunologische Toleranzmechanismen führen dabei oft zu Beeinträchtigung der Immunantwort. Deshalb ist hier die Reaktivierung der Pathogen-spezifischen Immunantwort eines der wichtigen Ziele einer therapeutischen Immunisierung. Im chronischen FV-Mausmodell wurde demonstriert, dass die einmalige therapeutische Immunisierung mit funktionalisierten CaP Nanopartikeln zu einer signifikanten Reduktion der Viruslast führt. Dabei scheint die Reaktivierung von Virus-spezifischen CD8+ T-Zellen und die Reduktion regulatorischer T-Zellen einen wichtigen Beitrag zu leisten. Zusammenfassend machen die Ergebnisse dieser Arbeit sehr deutlich, dass sich CaP Nanopartikel hervorragend als Immunisierungsvehikel eignen. Die umfangreichen Funktionalisierungsmöglichkeiten dieses Systems erlauben zusätzlich einen sehr flexiblen Einsatz dieser Nanopartikel gegen verschiedene akute und chronische Infektionen.

The immunological mechanisms against infectious diseases are very complex. The different parts of the immune system thereby show diverse effectivity against several pathogens. Due to morphology and pathology neutralizing antibody responses may protect against some viral infections but fail to prevent infection with others, like HIV. The ability of vaccines to induce T cell responses is crucial for preventing diseases caused by most intracellular pathogens like viruses or bacteria. Nanoparticles are considered as potent vaccination tools in new vaccine designs, since they mimic invading pathogens by their particular structure and can be functionalized with immunogenic parts of bacteria or viruses. The stimulation of certain specialized receptors with these structures therefore leads to an activation of the innate immune system. This study describes a novel vaccination approach with biodegradable calcium phosphate (CaP) nanoparticles functionalized with immunoactive Toll-like receptor 9 ligand (CpG) or Toll-like receptor 3 ligand poly(I:C) co-encapsulating virus derived peptides. Functionalized CaP nanoparticles are rapidly taken up by dendritic cells (DCs) which lead to successful maturation of DCs and the induction of virus-specific T cell responses. Immunization with functionalized CaP nanoparticles against influenza virus or the retroviral Friend virus elicited a potent T cell-mediated immune response with high numbers of anti-viral IFN-γ-producing CD4+ and CD8+ effector T cells. Challenge experiments demonstrated a significant reduction of viral loads. The results of this study demonstrate the high potential of these nanoparticles as novel and flexible tool for prophylactic vaccination. However, many viral infections do not result in pathogen clearance but rather in viral persistence and the development of a chronic state of infection. The immunological mechanisms of tolerance have a great impact on the immune response. Thus, the reactivation of the pathogen-specific immune responses is one of the main goals during therapeutic vaccination. Single shot immunization with functionalized CaP nanoparticles was sufficient to significantly decrease viral load in persistent Friend retroviral infection. Especially the reactivation of virus-specific CD8+ T cells and the reduction of regulatory T cells seem to mediate this effect. Taken together, these results recommend functionalized CaP nanoparticles as a novel immunization tool. The possibility of further modifications implies their use for several prophylactic and therapeutic immunizations.

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Knuschke, Torben: Etablierung und Charakterisierung von biodegradierbaren Calciumphosphat Nanopartikeln zur Induktion potenter anti-viraler T-Zellantworten. 2013.

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