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Plasmazytoide dendritische Zellen (PDC) : Suche nach einem Liganden des humanen PDC-spezifischen Oberflächenrezeptors CD303 und funktionelle Charakterisierung von murinen Sca-1+ und Sca-1- PDC-Subpopulationen

Niederquell, Marina

CD303 ist ein transmembranes Glykoprotein, welches zur Dectin-2-Familie der Typ II Calcium-abhängigen C-Typ-Lektine gehört, und wird spezifisch auf humanen plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDCs) exprimiert. CD303 interagiert mit der FcεRγ-Kette, wodurch es Funktionen eines Signalrezeptors ausübt. Die Bindung eines CD303-spezifischen Antikörpers induziert ein B-Zell-ähnliches Signalosom, welches zur Inhibition der Interferon-α (IFN-α)-Produktion in humanen PDCs führt. Eine unkontrollierte IFN-α-Ausschüttung wird in vielen Autoimmunerkrankungen wie systemischer Lupus erythematodes (SLE) oder Psoriasis als hauptsächlicher pathophysiologischer Faktor angesehen. Die Inhibition der IFN-α-Sekretion kann in diesem Zusammenhang ein wichtiges therapeutisches Mittel gegen Autoimmunerkrankungen sein. Die Isolation und Identifikation eines natürlichen endogenen CD303-Liganden (CD303L) kann folglich neue Erkenntnisse über die Regulation von CD303 und die Funktion von PDCs in der Autoimmunität bringen und war ein Ziel dieser Arbeit. Die Herstellung eines rekombinanten CD303-Fusionsproteins führte zunächst zur Definition von CD303L+ Zelllinien und Primärzellen, wobei Krebszelllinien, Monozyten und B-Zellen als Träger des auf der Zelloberfläche lokalisierten CD303L identifiziert werden konnten. Klassische Immunpräzipitationsexperimente und die Durchführung der optimierten Ligand-based Receptor Capturing (LRC)-Technologie resultierten in Vorschlägen von Kandidaten für den CD303L. Allerdings konnten sowohl GAPDH als auch CD222 in anschließenden Validierungsexperimenten nicht als CD303L bestätigt werden. Zellbasierte Funktionalitätsanalysen konnten mit Hilfe der A95-KK NFAT-GFP-Reporterzelllinie ebenso keinen funktionellen CD303L identifizieren. Mit diesem artifiziellen System konnte weiterhin die Funktionalität des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV)-Hüllproteins gp120, welches als ein funktioneller Ligand von CD303 beschrieben und für CD303 dadurch eine Rolle als Pathogenrezeptor vorgeschlagen wurde, im Verbund von HIV-1-Partikeln nicht bestätigt werden.
Zwar konnte gezeigt werden, dass die Bindung von rCD303 an seinen Liganden unabhängig von den Zuckermodifikationen des rekombinanten Proteins war, jedoch brachte erst die Studie von Riboldi und Kollegen im Jahre 2011 Gewissheit über die Identität des Liganden, der als asialo Galactosyl-Oligosaccharid endständiger Position eines Biantennenkomplexes identifiziert wurde.
Die Regulation der IFN-α-Produktion in PDCs kann auf unterschiedlichen Mechanismen basieren. Die Fähigkeit der PDCs auf bestimmte Antigene zu antworten, kann sowohl von der Art der Stimulation aber auch von der Existenz verschiedener PDC-Subpopulationen abhängen. Der Stammzellmarker Sca-1 (stem cell antigen-1) wurde als ein Marker, der differentiell in murinen PDCs exprimiert wird, identifiziert. Eine funktionelle Analyse der Sca-1+ und Sca-1- Subpopulationen war das Ziel des zweiten Projektes dieser Arbeit.
Es konnte bestätigt werden, dass die Sca-1-Expression unterschiedliche Entwicklungsstadien von PDCs definiert. Sca-1- PDCs zeigten dabei einen Vorläufer-Phänotyp. Sie wiesen eine erhöhte Proliferationsaktivität auf und residierten primär im Knochenmark, während Sca-1+ PDCs durch eine verstärkte Expression von MHC-II-Molekülen eher einen reiferen Phänotyp repräsentierten und mit hohen Frequenzen in den Lymphknoten zu finden waren. Repopulationsuntersuchungen in der CD303-Diphtherietoxin-Rezeptor transgenen Maus, in der durch die Zugabe von Diphterietoxin alle endogenen PDCs depletiert werden konnten, zeigten, dass sich zuerst Sca-1- PDCs und nachfolgend Sca-1+ PDCs entwickelten. Die Regulation der Sca-1-Expression erfolgte dabei durch lokale Faktoren des Mikromilieus des jeweiligen Organs. Die Sca-1-Expression konnte durch eine TLR7/9-abhängige Aktivierung der Zellen induziert werden. Die Stimulation mit dem endosomalen TLR9-Liganden CpG-A zeigte eine Heterogenität der Zellen in ihrer Fähigkeit zur IFN-α-Produktion. Sca-1+ PDCs produzierten geringe Mengen an IFN-α verglichen mit Sca-1- Zellen, die folglich als die wahren natürlichen IFN-α-Produzenten identifiziert wurden. Interessanterweise war diese Diskrepanz nach lysosomaler TLR9-Stimulation der Zellen mit CpG-B in der Produktion proinflammatorischer Zytokine nicht detektierbar. Um die molekularen Mechanismen, die zur funktionellen Heterogenität der Sca-1-Subpopulationen nach endosomaler, aber nicht lysosomaler TLR9-Stimulation führten, zu ermitteln, wurden Microarray-Analysen mit sortierten Sca-1+ und Sca-1- PDCs durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Osteopontin (Opn) stark in Sca-1- PDCs hochreguliert war. Literaturhinweise belegen, dass die intrazelluläre Isoform von Opn den endosomalen TLR9-Signalweg mit der IFN-α-Produktion koppelt, wodurch die funktionelle Heterogenität der beiden Sca-1-Subpopulationen erklärt werden könnte.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Regulation der IFN-α-Produktion in PDCs entscheidend für die Funktion der Zellen unter normalen und pathologischen Bedingungen ist. Sowohl im humanen als auch im murinen System gibt es Mechanismen, die die Fähigkeit der IFN-α-Produktion in PDCs modulieren können. Eine spezifische Interaktion des humanen PDC-Rezeptors CD303 mit putativen Liganden, die endständige asialo Galactosyl-Oligosaccharide tragen, aber ebenso der Einfluss lokaler Faktoren, die zur Veränderungen des murinen PDC-Phänotyps führen, können die Produktion von IFN-α in PDCs reduzieren oder sogar komplett inhibieren.

CD303 is a type II C-type lectin that is expressed on human plasmacytoid dendritic cells (PDCs). Triggering the transmembrane receptor with CD303-specific antibody leads to the activation of a BCR-like signalosome and the inhibition of type I interferon (IFN-I) secretion in PDCs. The natural ligand of CD303 (CD303L) is unknown and targeting of this ligand-receptor interaction could be a successful therapeutic strategy against many autoimmune diseases like systemic lupus erythematosus and psoriasis where IFN-α is considered to be the major pathophysiological factor. The isolation and characterization of an endogenous CD303L may give further insights into the regulation of CD303 and the function of PDCs in autoimmunity, and thus was the aim of the first part of the project.
A number of different methodologies were applied to reach this goal, including recombinant CD303 protein expression, immunoprecipitation, ligand-based receptor capturing (LRC) experiments and cell assays using NFAT-GFP reporter cells. Although many CD303L+ cell lines (mainly cancer cell lines) and primary cells (monocytes and B cells) have been identified, the isolation of a CD303L failed. Furthermore, no functional properties of CD303L expressed on the cell surface of CD303L+ cells were observed. Nevertheless, a calcium-dependent ligand-receptor interaction was confirmed which was independent of the carbohydrate residues on rCD303 itself. Finally, Riboldi and colleagues identified CD303 as a receptor for terminal asialo galactosyl-oligosaccharides.
The regulation of IFN-α production by PDCs, which were believed to link the innate and adaptive immunity, is based on different mechanisms. The capability of PDCs to respond to various antigens may depend on both, the nature of the stimulus and the existence of different PDC subpopulations. The stem cell marker Sca-1 (stem cell antigen-1) was shown to be differentially expressed on murine PDCs. The aim of the second part of this thesis was the functional characterization of Sca-1+ and Sca-1- PDC subpopulations.
Sca-1- PDCs represent the early developmental stage of PDCs, confirming previous results. These cells were predominantly found in the bone marrow, whereas Sca-1+ PDCs were located with high frequencies in secondary lymphoid organs and showed a more mature phenotype due to the higher expression of MHC class II molecules. Repopulation studies using a CD303-diphtheria toxin receptor transgenic mouse model revealed that the Sca-1- PDC subpopulation reconstituted first followed by the appearance of Sca-1+ PDCs when endogenous PDCs were depleted with diphtheria toxin. Moreover, Sca-1 expression in the newly developing PDCs was regulated by local factors of the organ microenvironment. Interestingly, Sca-1 expression could also be induced via TLR-dependent activation of the cells. Using the endosomal TLR-9 ligand CpG-A, different responses in the IFN-α production of stimulated Sca-1 subpopulations were observed. Sca-1+ PDCs produced diminished levels of IFN-α when compared to Sca-1- PDCs suggesting that Sca-1- PDCs are the rather true natural IFN-α producers. Stimulation with the lysosomal TLR9 ligand CpG-B, however, did not show any functional differences in the production of proinflammatory cytokines. In order to identify the molecular mechanisms leading to the functional heterogeneity upon endosomal but not lysosomal TLR-9 stimulation, microarray gene expression analyses were performed using purified Sca-1+ and Sca-1- PDCs. Interestingly, osteopontin (Opn) was strongly upregulated in Sca-1- PDCs and the intracellular isoform of Opn has been described to couple TLR9 signaling to IFN-α production in PDCs, which may provide evidence for the molecular basis of the functional heterogeneity between both subpopulations.
In summary, the regulation of IFN-α production in PDCs is essential for the function of PDCs under normal and pathological conditions such as cancer and autoimmune diseases. In humans as well as in the mouse system, mechanisms exist that modulate the capacity of IFN-α production in PDCs. Specific interactions of the human PDC receptor CD303 with terminal asialo galactosyl-oligosaccharides but also local environmental factors that change the phenotype of mouse PDCs may reduce or even completely inhibit the production of IFN-α in PDCs.

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Niederquell, Marina: Plasmazytoide dendritische Zellen (PDC). Suche nach einem Liganden des humanen PDC-spezifischen Oberflächenrezeptors CD303 und funktionelle Charakterisierung von murinen Sca-1+ und Sca-1- PDC-Subpopulationen. 2013.

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