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Integration of hygienically relevant bacteria in drinking water biofilms grown on domestic plumbing materials

Moritz, Miriam

Biofilms in domestic plumbing systems can represent a reservoir for potentially pathogenic bacteria including Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila and coliform bacteria. The selection of materials utilised in domestic plumbing as well as their exposure to disinfectant stress (“ageing”) may affect the extent of biofilm formation, the composition of biofilm populations and the incorporation and persistence of hygienically relevant bacteria in drinking water biofilms. The presence of protozoa may additionally influence the persistence and multiplication of potentially pathogenic bacteria.
Drinking water biofilms were grown on coupons of plumbing materials including ethylene-propylene-diene-monomer (EPDM) rubber, silane cross-linked polyethylene (PE-Xb), electron-ray cross-linked PE (PE-Xc) and copper under constant flow-through of cold tap water at ambient temperature (19.0 °C ± 3.1 °C). The materials were tested both untreated and after treatment with sodium hy¬pochlorite (5 ppm, 3 bar, 40 °C, 4 weeks) or chlorine dioxide (5 ppm, 3 bar, 40 °C, 4 weeks) in case of EPDM, PE-X b and c or after exposure to unchlorinated drinking water for ≥ 6 months in case of copper. After 14 days, the biofilms were spiked with Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila and Enterobacter nimipressuralis (106 cells/mL each). The test bacteria were environmental isolates from contamination cases in drinking water systems. After static incubation for 24 h, water flow was resumed and continued for four weeks. Total cell count and heterotrophic plate count (HPC) of biofilms were monitored, and the population diversity of was determined using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). P. aeruginosa, L. pneumophila and E. nimipressuralis were quantified, using standard culture-based methods or culture-independent fluorescence in situ hybridisation (FISH). 14 day-old biofilms grown on untreated EPDM, PE-Xb, PE-X c and copper were analysed for the presence of total protozoa and the amoebal genera Acanthamoeba and Hartmannella using FISH.
After 14 days total cell counts and HPC values were highest on EPDM followed by the plastic materials and copper. The diversity of biofilm populations was higher in biofilms grown on synthetic materials (EPDM, PE-Xb, PE-Xc) compared to biofilms grown on copper. Amoebae were present in drinking water biofilms grown on all domestic plumbing materials tested, with Acanthamoebae and Hartmannella being the prevalent genera. Material ageing did not significantly influence biofilm formation and biofilm population diversity. After inoculation, P. aeruginosa persisted for 28 days in biofilms on EPDM, PE-Xb and PE-Xc, but was unable to colonise copper biofilms. L. pneumophila persisted in biofilms on any of the materials for 28 days. E. nimipressuralis was not detected in any of the biofilms. The aged materials did not show significant differences compared to untreated materials regarding the incorporation of P. aeruginosa and L. pneumophila into biofilms. Application of FISH showed that P. aeruginosa and L. pneumophila often persisted in higher concentrations than detected by culture-based methods indicating that part of the P. aeruginosa and L. pneumophila populations entered a viable but non-culturable (VBNC) state, in which they were not detectable with standard culture methods.
Additional investigations on P. aeruginosa pure cultures showed that copper can be one of the stress factors inducing the VBNC state in drinking water and drinking water biofilms of domestic plumbing systems. Planktonic and biofilm-associated P. aeruginosa in the VBNC state became culturable again upon the release of copper stress by incubation in the presence of the chelator diethyldithiocarbamate (DDTC).
The results show that biofilm formation measured as total cell count and HPC as well as biofilm population diversity are material dependent, but not influenced by material ageing. P. aeruginosa and L. pneumophila are able to incorporate into and persist in drinking water biofilms grown on materials relevant in domestic plumbing. Material ageing did not have an influence on pathogen persistence. The detection of amoebae in all drinking water biofilms suggests that these organisms can interact and probably serve as a host for hygienically relevant bacteria, at least for L. pneumophila. The concentrations of P. aeruginosa and L. pneumophila in drinking water biofilms may be underestimated by conventional culture-based methods. Hygienically relevant bacteria that are not culturable may still be viable and of hygienic relevance as they can retain their virulence or regain it upon resuscitation.

Biofilme in Trinkwasser-Installationen können ein Reservoir für hygienisch relevante Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila und coliforme Bakterien darstellen. Die Auswahl der in der Trinkwasser-Installation eingesetzten Werkstoffe sowie ihre Beanspruchung durch Desinfektionsmaßnahmen („Alterung“) können möglicherweise die Einnistung hygienisch relevanter Bakterien in Biofilme beeinflussen. Die Anwesenheit von Amöben kann einen zusätzlichen Effekt auf die Einnistung und Vermehrung hygienisch relevanter Bakterien in Trinkwasserbiofilmen haben. In dieser Arbeit wurde die Einnistung von P. aeruginosa und L. pneumophila in Trinkwasserbiofilme auf unbehandelten und gealterten Werkstoffen der Trinkwasser-Installation untersucht. Es handelte sich um Ethylen-Propylen-Dien-Monomer-Kautschuk (EPDM), silanvernetztes Polyethylen (PE-Xb), strahlenvernetztes PE (PE-Xc) und Kupfer. Die Alterung von EPDM, PE-Xb und PE-Xc bestand aus einer Behandlung mit Natriumhypochlorit bzw. Chlordioxid oder im Fall des Kupfers aus der Exposition in einem realen Trinkwasserverteilungssystem für mindestens 6 Monate. In Edelstahlreaktoren wurden Trinkwasserbiofilme auf Coupons dieser Werkstoffe angezüchtet und nach 14 Tagen mit P. aeruginosa, L. pneumophila und Enterobacter nimpressuralis (je 106 Zellen/mL) angeimpft. Nach Stagnation für 24 h wurden die Reaktoren für 4 Wochen mit Trinkwasser durchströmt. Die Gesamtzellzahl und Koloniezahl der Biofilme wurden bestimmt und die Diversität der Biofilmpopulationen wurde mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion-Denaturierenden Gradientenelelektrophorese (PCR-DGGE) analysiert. Die Zielorganismen wurden mit kulturellen Standardverfahren sowie mit der kultivierungsunabhängigen Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) quantifiziert. Das Auftreten von Gesamtprotozoen und Amöben der Gattungen Acanthamoeba und Hartmannella wurde mittels FISH untersucht.
Nach 14 Tagen hatten sich Biofilme mit unterschiedlicher Zelldichte gebildet. Am höchsten war die Besiedlung auf EPDM, gefolgt von PE-Xb, PE-Xc und Kupfer. Die Diversität der Biofilmpopulationen war in Biofilmen auf Kunststoffen (EPDM, PE-Xb und c) größer als in Biofilmen auf Kupfer. Die Werkstoff-Alterung hat keinen Einfluss auf die Biofilmbildung und die Populationsdiversität der Trinkwasserbiofilme. Acanthamoeba spp. und Hartmannella spp. wurden in Biofilmen auf allen Werkstoffen nachgewiesen. P. aeruginosa persistierte für bis zu 28 Tage in Biofilmen auf EPDM und PE-Xb und c, konnte aber in Biofilmen auf Kupfer nicht nachgewiesen werden. L. pneumophila kolonisierte Biofilme auf allen Materialien und wurde noch 28 Tage nach Animpfen detektiert. E. nimipressuralis wurde in keinem der Biofilme nachgewiesen. Die desinfektionsmittel-behandelten Materialien zeigten in Bezug auf die Einnistung von P. aeruginosa und L. pneumophila keine deutlichen Unterschiede zu den unbehandelten Materialien. Mit der FISH-Methode wurden in vielen Fällen höhere Konzentrationen von P. aeruginosa und L. pneumophila nachgewiesen als mit kulturellen Verfahren. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass ein Teil der P. aeruginosa und L. penumophila Populationen im Biofilm in einen nicht kultivierbaren ("viable but non-culturable", VBNC) Zustand übergehen. Zusätzliche Untersuchungen mit P. aeruginosa Reinkulturen zeigten, dass Kupfer einer der Faktoren ist, der den Übergang in den VBNC Zustand in Trinkwasser und Trinkwasser-Biofilmen induzieren kann. Durch Kupfer gestresste und somit nicht kultivierbare planktonische und Biofilm-assoziierte P. aeruginosa konnten durch Zugabe des Chelators Diethyl-Dithiocarbamat wieder in einen kultivierbaren Zustand überführt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die Besiedlungsdichte als auch die Entwicklung der Biofilmpopulationen materialabhängig stattfinden. Biofilmbildung und Populationsdiversität waren jedoch unabhängig von einer Material-Alterung. P. aeruginosa und L. pneumophila können sich in Trinkwasserbiofilme auf Materialien der Trinkwasser-Installation einnisten und dort persistieren. Eine Alterung der Werkstoffe durch die chemische Desinfektion (Behandlung mit Natriumhypochlorit oder Chlordioxid) oder Trinkwasser-Exposition hat keinen wesentlichen Einfluss auf die Einnistung der untersuchten hygienisch relevanten Bakterien. Die Anwesenheit von Amöben in Trinkwasserbiofilmen deutet darauf hin, dass diese Organismen im Biofilm mit hygienisch relevanten Bakterien in Wechselwirkung treten und als potenzieller Wirt für intrazelluläre Vermehrung dienen können. Dies wurde bereits in anderen Studien für L. pneumophila nachgewiesen. Ein Teil der Zielorganismen geht im Biofilm in einen nicht kultivierbaren (VBNC) Zustand über, in dem sie mit kulturellen Standardmethoden nicht nachgewiesen werden aber dennoch vorhanden sind und von hygienischer Bedeutung sein können.

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Moritz, Miriam: Integration of hygienically relevant bacteria in drinking water biofilms grown on domestic plumbing materials. 2011.

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