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Funktionelle Interaktion von E1A-Onkoproteinen mit Chromatin-remodellierenden Faktoren bei der Transkriptionsregulation des zellulären PCNA-Gens

Schwan, Alexandra

E1A Onkoproteine können durch Kooperation mit epigenetischen Modifikatoren wie den Chromatin-remodellierenden Faktoren eine transkriptionelle Reprogrammierung CREB-abhängiger viraler sowie spezifischer zellulärer Gene erzielen. So konnte in unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass die adenoviralen E1A-Proteine mit der ATPase- Untereinheit humanes (h)BRG der Adenosin-5`-triphosphat (ATP)- abhängigen, Chromatin-remodellierenden hSWI/SNF Komplexe bei der Modulation und Aktivierung des cAMP/PKA-abhängigen viralen E2Ad12- Promotors in vitro und in vivo interagieren. Zur Untersuchung der promotorspezifischen Rekrutierung der SWI/SNF-Komplexe durch das E1A Onkoprotein an den zellulären Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)- Promotor habe ich im Zuge der vorliegenden Arbeit in einem neuen Modellsystem eine PCNA-Promotorsequenz so in einen Expressionsvektor kloniert, dass ein Reportergen, in diesem Fall das Luciferase-Gen, unter die transkriptionelle Kontrolle des PCNA-Promotors gestellt wird. Mit diesen Promotorstudien zur transkriptionellen Aktivierung des PCNA-Promotors in transienten Expressionsassays in Gegenwart von E1A12S und den SWI/SNF-Untereinheiten hBRG1 und hBRM, konnte ich eine funktionelle Interaktion sowohl der ATP-utilisierenden Untereinheit hBRG, als erstmals auch hBRM, mit dem E1A12S Protein bei der Aktivierung der Genexpression dieses zellulären PCNA- Schlüsselproteins nachweisen. Die hierbei beobachtete funktionelle Interaktion auch mit hBRM könnte Ausdruck der biologischen Funktionsausübung der ATPase- Untereinheiten hBRM und hBRG an unterschiedlichen Genen der Zelle sein. Darüber hinaus konnte ich in meinen Experimenten erstmals eine funktionelle Interaktion zwischen Histonacetyltransferase (HAT)- und SWI/SNF- Komplexen mit dem E1A-Onkoprotein im Aktivierungsprozess dieses zellulären Gens nachweisen, da die Histondeacetylase-1 (HDAC-1) die hBRG- vermittelte Aktivierung des PCNA-Promotors reprimieren kann. Konsekutiv stellt die HAT- Aktivität eine wichtige Prärequisite für die Rekrutierung der hSWI/SNF- Komplexe an diesen Promotor dar. Zusätzlich zur Reprogrammierung des zellulären Genexpressionsprofils kann die genaue zeitliche Abfolge der Bindung von E1A an seine Zielstrukturen wichtige Erkenntnisse über den Mechanismus der Zelltransformation liefern. Eine genaue zeitliche Reaktionskaskade mit Ausbildung eines ternären Komplexes im Aktivierungsprozess des untersuchten zellulären, CRE-abhängigen PCNA-Promotors durch den cAMP/PKA-abhängigen Signaltransduktionsweg, wurde daher unter besonderer Berücksichtigung der funktionellen Interaktion der E1A12S Onkoproteine mit den Chromatin-remodellierenden Faktoren in der vorliegenden Arbeit vorgeschlagen. Die Ergebnisse ermöglichen neue Einsichten in die E1A-induzierte Zellzyklusregulation, da die direkte Interaktion der E1A-Onkoproteine mit den Untereinheiten hBRG1 und auch hBRM der SWI/SNF-Komplexe, als möglicher Grund der E1A- induzierten Aufhebung des Zellzyklus-Arrestes in Betracht gezogen werden muss. Die Fähigkeit kleiner DNA-Tumorviren, wie hier exemplarisch durch das adenovirale E1A12S-Protein dargestellt, die Zelle durch den Zellzyklus zu lotsen, kann möglicherweise Parallelen zu nichtviralen Mechanismen der Onkogenese bereithalten.

E1A oncoproteins are known to be capable of transcriptional reprogramming of certain CREB- dependent viral and cellular genes through the use of epigenetic modifiers. Thus, our lab has been able to show the interaction of adenoviral E1A oncoproteins with the ATPase subunit human (h)BRG of the hSWI/SNF chromatin-remodelling complexes in the cAMP/PKA-dependent activation and modulation process of the viral E2Ad12 promoter both in vitro and in vivo. In order to provide an insight into the promoter-specific recruitment of the human hSWI/SNF-complexes to the cellular Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)-promoter by the E1A12S-oncoprotein, I established a new model-system by cloning a minimal PCNA promoter sequence into a customary reporter vector. This reporter vector consisted of a particular reporter gene, i.e. the luciferase-gene, which was thereby put under transcriptional control of the PCNA-promoter. These promoter studies enabled me to verify the functional interaction of the ATP (adenosine-5`-triphosphate)- utilising subunits hBRG as well as hBRM of the SWI/SNF-complex with the E1A12S - protein in the CREB- dependent activation process of this cellular key promoter in transient expression assays. As a side-effect, I was able to show a functional link between E1A and the hBRM subunit of the SWI/SNF-complex, whereas previous studies in our lab had merely proven this interaction for E1A and the hBRG-subunit. This might be a notice for the fact, that the hSWI/SNF-subunits hBRM and hBRG exert their biological functions on different cellular target genes. Furthermore, my experiments demonstrated for the first time a functional interaction between HAT (histone-acetyltransferase)- and SWI/SNF-complexes with the E1A protein in the activation process of the cellular PCNA-promoter, as the histone deacetylase-1 (HDAC-1) was shown to repress the hBRG mediated activation of this so-called “ringmaster of the genome” (Paunesku et al., 2001). Consequently, the HAT-activity can be considered as an important precondition for the recruitment of SWI/SNF- complexes to this promoter by the E1A oncoprotein. In addition to changes in gene expression, the temporal order of E1A binding to its target genes may harbour important lessons for cellular transformation. Therefore I proposed a precise temporal reaction cascade, consisting of the formation of a ternary complex among other crucial steps, in the activation process of the CRE-dependent PCNA-promoter via the cAMP/PKA signal transduction pathway. Within the framework of the present dissertation, the establishment of this cascade accounted particularly for the functional interaction of the E1A oncoproteins with chromatin-remodelling factors. These findings provide new insights into E1A induced cell-cycle regulation, since, for the first time, the direct interaction of the E1A12S-protein with the hBRG and hBRM subunits of the SWI/SNF-complex has to be appreciated as a possible cause for the E1A-induced abrogation of the cell cycle arrest. The outlined capability of the adenoviral E1A12S protein as a representative of small DNA tumor viruses, to steer cells through the cell cycle may have parallels in nonviral mechanisms of oncogenesis.

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Schwan, Alexandra: Funktionelle Interaktion von E1A-Onkoproteinen mit Chromatin-remodellierenden Faktoren bei der Transkriptionsregulation des zellulären PCNA-Gens. 2010.

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