@PhdThesis{duepublico_mods_00021587,
  author = 	{Mamant, Nicolette},
  title = 	{Charakterisierung des Aktivierungsmechanismus der HtrA-Protease DegP von E. coli},
  year = 	{2010},
  month = 	{Jan},
  day = 	{08},
  keywords = 	{HtrA; DegP; PDZ},
  abstract = 	{Das periplasmatische Hitzeschockprotein DegP spielt eine entscheidende Rolle in der bakteriellen Proteinqualit{\"a}tskontrolle und besitzt eine Doppelfunktion als Protease und Chaperon. Es geh{\"o}rt zu der konservierten Familie der HtrA-Proteasen, deren Mitglieder eine katalytische Serinproteasedom{\"a}ne mit mindestens einer PDZ-Dom{\"a}ne kombinieren und wichtige physiologische Funktionen in lebenden Zellen einnehmen. DegP wird in seiner Proteaseaktivit{\"a}t temperaturabh{\"a}ngig und allosterisch aktiviert. Der allosterische Mechanismus dominiert dabei die temperaturabh{\"a}ngige Aktivierung und geht einher mit einer Verschiebung des oligomeren Zustandes vom hexameren Ruhezustand zu proteolytisch aktiven 12 und 24meren Partikeln. W{\"a}hrend diese Erkenntnisse prim{\"a}r auf strukturellen Daten basieren, ist der zugrunde liegende Mechanismus bisher nicht vollst{\"a}ndig gekl{\"a}rt. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue mechanistische Einblicke in die DegP-Aktivierung und Oligomerisierung zu gewinnen. Dazu wurden Mutationsanalysen mit Enzymtests, in vivo Komplementationstests, Oligomerisierungs- und Bindungsstudien sowie massenspektrometrischen Untersuchungen kombiniert. Der Fokus wurde dabei insbesondere auf die PDZ1- Dom{\"a}ne gerichtet. Dar{\"u}ber hinaus wurden die Loops L3 und L2 der Proteasedom{\"a}ne genauer untersucht. Die Ergebnisse der Analysen best{\"a}tigten den postulierten Zusammenhang der Aktivierung und Oligomerisierung und resultierten in einem m{\"o}glichen mechanistischen Modell der DegP-Regulation. Es wurde gezeigt, dass 7mere und 10mere Peptide im Zuge der Aktivierung spezifisch an die PDZ1-Dom{\"a}ne binden und strukturelle Umorientierungen in der Proteasedom{\"a}ne induzieren. Dabei findet eine Kommunikation zwischen den Elementen PDZ1, Loop L3, Loop LD und Loop L2 statt, die letztendlich zu der Ausbildung eines intakten aktiven Zentrums f{\"u}hrt. Die aktive Form des Proteins assembliert zu 12 und 24meren Homooligomeren, die einen Innenraum f{\"u}r die hoch effiziente Degradation des Proteinsubstrats zur Verf{\"u}gung stellen. Mittels Bindungsstudien wurde in diesem Zusammenhang eine direkte Korrelation zwischen der St{\"a}rke der Peptidbindung und dem Grad der DegP-Aktivierung und Oligomerisierung gezeigt. Au{\ss}erdem wurde gezeigt, dass die PDZ1-Dom{\"a}ne eine essentielle Rolle f{\"u}r die enzymatische Aktivit{\"a}t, die Aktivierung und die Oligomerisierung einnimmt. Im Weiteren konnte die Hypothese aufgestellt werden, dass die PDZ1-Dom{\"a}ne und das aktive Zentrum {\"a}hnliche Sequenzspezifit{\"a}ten besitzen, was eine prozessive Hydrolyse der DegP-Substrate erm{\"o}glicht, bei der die PDZ1- und Proteasedom{\"a}ne miteinander kooperieren. Dar{\"u}ber hinaus gaben die Analysen der Loops L3 und L2 Aufschluss {\"u}ber die bedeutsame Rolle dieser Elemente f{\"u}r die proteolytische Aktivit{\"a}t, die Aktivierung und die Oligomerisierung. Mit dem in dieser Arbeit aufgestellten mechanistischen Modell wurde ebenfalls zu der Kl{\"a}rung der Frage beigetragen, wie DegP zwischen reparierbaren und degradierbaren Substraten unterscheidet. Demnach bestimmen Substrate ihr Schicksal selbst mit, indem sie die Faltung des Hexamers und der h{\"o}heren aktiven Oligomere selbst initiieren und DegP auf diese Weise allosterisch aktivieren. W{\"a}hrend ungefaltete Proteine prozessiv degradiert werden, werden gefaltete Molek{\"u}le vermutlich im Innenraum des aktiven DegP vor der Proteolyse gesch{\"u}tzt und reparierbare Proteine in der R{\"u}ckfaltung unterst{\"u}tzt. In einem weiteren Schritt dieser Arbeit wurden neue DegP-Aktivatoren identifiziert. Dabei handelte es sich zum einen um den Aktivator DPMFKLV, der im Verlauf der Arbeit bereits erfolgreich f{\"u}r die Aufkl{\"a}rung des Aktivierungsmechanismus eingesetzt wurde. Das Screening einer E. coli Peptidbibliothek f{\"u}hrte zum anderen zu der Identifizierung der zwei Aktivatorpeptide CHHSAFPVFL und DYFGSALLRV, die die C-Termini zweier E. coli Zellh{\"u}llproteine darstellen. Die Erkenntnisse dieser Arbeit k{\"o}nnen zuk{\"u}nfig zu der Aufkl{\"a}rung der Regulationsmechanismen anderer HtrA-Proteasen beitragen. Von medizinischem Interesse ist in diesem Zusammenhang zum Beispiel das humane HtrA1, dem eine Rolle in der Tumorentstehung und Progression sowie in Proteinfaltungskrankheiten wie Arthritis, Morbus Parkinson und der Alzheimerschen Krankheit zugesprochen wird.},
  url = 	{https://duepublico2.uni-due.de/receive/duepublico_mods_00021587},
  file = 	{:https://duepublico2.uni-due.de/servlets/MCRFileNodeServlet/duepublico_derivate_00023453/Dissertation_Nicolette_Mamant.pdf:PDF},
  language = 	{de}
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