@PhdThesis{duepublico_mods_00010365,
  author = 	{Schildgen Dr., Oliver},
  title = 	{Identifizierung einer O-Glykosylierungsstelle der Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) preS2-Dom{\"a}ne und deren Einflu{\ss} auf den intrazellul{\"a}ren Transport des middle surface antigen (WHmsAg)},
  keywords = 	{Woodchuck-Hepatitis-Virus; pres2-Protein; O-Glykosylierungsstelle},
  abstract = 	{Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Glykosylierung des middle surface antigen des Woodchuck Hepatitis Virus untersucht werden. Dazu wurden chim{\"a}re Proteine aus der WHVpreS2/S-Region und dem S-Antigen von HBV mit der HBV {\textasciiacute}a{\textasciiacute}-Determinante konstruiert. In der preS2-Region konnte durch zielgerichtete Mutagenese und in vitro Translations-Assays eine O-Glykosylierungsstelle an Position 5 (Thr) der Aminos{\"a}uresequenz identifiziert werden. Mit Hilfe von Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen und Konfokalmikroskopie wurde gezeigt, da{\ss} die Glykosylierung des preS2-Proteins eine wichtige Rolle f{\"u}r den intrazellul{\"a}ren Transport dieses Proteins spielt. Dabei wurde deutlich, da{\ss} falsche oder fehlende Glykosylierung zu einer ringf{\"o}rmigen Anreicherung des preS2-Proteins f{\"u}hrt. Diese Ringbildung erfolgt nach den vorliegenden Daten zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat, also in dem zellul{\"a}ren Kompartiment, das f{\"u}r die O-Glykosylierung verantwortlich ist. Dies ist eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung f{\"u}r den Erfolg einer Therapie mit Glykosylierungsinhibitoren. Vergleichende Studien mit einer preS2-minus Chim{\"a}re zeigten, da{\ss} die Ringbildung nur bei fehlender Glykosylierung des preS2-Proteins auftritt, nicht aber bei nicht-Translation der preS2-Dom{\"a}ne. Der Therapieerfolg mit Glykosylierungsinhibitoren im Falle einer Infektion mit HBV-Varianten, denen das preS2-Protein fehlt, ist also fraglich.Desweiteren sollte die Replikationskompetenz von WHV-St{\"a}mmen mit Glykosylierungsdefekt sollte mit Hilfe in vivo Transfektionen untersucht werden. Im Rahmen dieser Versuche konnte jedoch allenfalls die kurzfristige Expression viraler Proteine nachgewiesen werden, nicht aber die Replikation der glykosylierungsdefekten oder preS2minus Mutante. Ein Virustiter und damit Replikation konnte nicht nachgewiesen werden, und zwar weder f{\"u}r die preS2minus-Mutante, noch f{\"u}r die Variante mit dem Glykosylierungsdefekt.Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine RNase Protection Assay etabliert. Mit Woodchuck-spezifischen Sonden, sogenannten Riboprobes, kann die Expression der Cytokine IFN-g, TNF-a und IL-15 sowie der T-Zellmarker CD3, CD4 und CD8 qualitativ und quantitativ untersucht werden. Es wurde gezeigt, da{\ss} die Marker CD3, CD4 und CD8 w{\"a}hrend der chronischen Infektion st{\"a}rker exprimiert werden als in der Akutphase der Infektion. Alle untersuchten Cytokine und T-Zellmarker sind w{\"a}hrend der chronischen Infektion nat{\"u}rlichen Schwankungen unterworfen. Ausgehend von einem Mittelwert betragen diese Schwankungen {\textpm} 50{\%}, gemessen in DLU. Diese Fluktuationen sind zehnmal so hoch wie die Schwankungen, die man beobachtet, wenn man zu einem einzigen Zeitpunkt multiple Biopsien aus verschiedenen Regionen einer einzigen Leber untersucht. Ebenfalls konnten unterschiedliche Expressionsmuster bei verschiedenen Tiere beobachtet werden.Der RNase Protection Assay konnte bereits in mehreren Projekten erfolgreich zur Untersuchung der Cytokin- und T-Zellmarker-Expression eingesetzt werden. So konnte gezeigt werden, da{\ss} das Immunmodulans a-Galaktosyl-Ceramid Spezies-spezifisch wirkt, und im Woodchuck nicht zu einer Erh{\"o}hung der Interferon-g Expression f{\"u}hrt.Mit Hilfe des RPA konnte dar{\"u}ber hinaus die Erh{\"o}hung der CD4, CD8 und Interferon-g Expression nach einer Tumortherapie mit einem rekombinanten Adenovirusvektor nachgewiesen werden. Die Erh{\"o}hung der Expression dieser Marker erfolgte durch einen Gentransfer der Gene f{\"u}r IL-12 und B7.1. Dar{\"u}ber hinaus sind seit kurzem Interferon-a und GAPDH aus dem Woodchuck als Konstrukte f{\"u}r den RNase Protection Assay verf{\"u}gbar (Daten nicht gezeigt, Klonierung erfolgte analog zu 3.14), wodurch weitere Untersuchungen der Woodchuck-Immunantwort erm{\"o}glicht werden.Durch die Expression des Interferon-g-Rezeptors des Murmeltiers wurde der Grundstein f{\"u}r weitere Untersuchungen der Interferon-g Wirkung gelegt. Aufgrund der bisherigen Daten m{\"u}{\ss}te es daher in absehbarer Zukunft m{\"o}glich sein, weitere immunologisch-virologische Studien der hepadnaviralen Infektion im nat{\"u}rlichen Infektionsmodell durchzuf{\"u}hren.},
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